C X chuẩn thêm vào
4.3.4.3.Ph−ơng pháp thử
Kiểm nghiệm thuốc bằng ph−ơng pháp sinh học
4.3.4.3.Ph−ơng pháp thử
•
•
•
Môi tr−ờng:
Đa số các d−ợc điển th−ờng dùng môi tr−ờng thạch casein đậu t−ơng để đếm vi khuẩn hiếu khí, môi tr−ờng thạch Sabouraud - kháng sinh để đếm vi nấm. Cũng có thể dùng môi tr−ờng thạch th−ờng để thử vi khuẩn hiếu khí vì môi tr−ờng này rất thích hợp cho sự phát triển của đa số vi khuẩn hiếu khí (theo D−ợc điển Trung Quốc 1997)
Chuẩn bị mẫu thử:
Mẫu thử theo quy định chung đ−ợc lấy 10g (hoặc 10 ml) để thí nghiệm. − Mẫu thử là chất rắn hay chất lỏng có thể làm thành dung dịch hay nhũ
dịch trong n−ớc, đ−ợc pha loãng vào dung dịch đệm phosphat pH =7,2 hoặc dung dịch NaCl 0,9% để đ−ợc nồng độ 10-1 sau đó pha các nồng độ tiếp theo 10-2, 10-3 … tuỳ theo yêu cầu thí nghiệm.
− Mẫu thử là chất lỏng không hoà lẫn vào n−ớc nh− dạng dầu, kem, hoặc thuốc mỡ. Cần chế tạo nhũ dịch bằng cách thêm một l−ợng chất nhũ hoá vô trùng thích hợp nh− tween 20, tween 80, làm nóng nhẹ 45oC để tạo một nhũ dịch đồng nhất.
Kiểm tra chất ức chế:
Kết quả thí nghiệm sẽ không có giá trị nếu trong mẫu thử có chất bảo quản hoặc các thành phần có ảnh h−ởng đến sự phát triển của vi sinh vật. Vì vậy, cần kiểm tra chất ức chế tr−ớc khi đếm số l−ợng vi sinh vật.
− Vi sinh vật chỉ thị:
Staphylococcus aureus (đại diện vi khuẩn G +).
Escherichia coli (đại diện vi khuẩn G -).
Candida albicans (đại diện vi nấm).
Các chủng trên đ−ợc nuôi cấy trong các môi tr−ờng dinh d−ỡng thích hợp sau 18 - 24 giờ (đối với vi khuẩn) và 24 đến 48 giờ đối với vi nấm, đ−ợc làm thành nhũ dịch có khoảng 100 tế bào/ ml.
− Cách tiến hành:
Đĩa thử 1: Cho 1ml chất thử ở nồng độ thích hợp. Đĩa thử 2: 1 ml chất thử + 1ml nhũ dịch vi sinh vật.
Đĩa chứng: 1ml n−ớc cất vô trùng + 1ml nhũ dịch vi sinh vật
Cho vào mỗi đĩa 15 - 20 ml môi tr−ờng dinh d−ỡng thích hợp đã để nguội d−ới 45oC.
ủ 30 - 35oC/ 24 - 48 giờ đối với vi khuẩn và 25 - 28oC/48 - 72 giờ đối với C. albicans.
− Nhận xét kết quả:
Đếm số khuẩn lạc vi sinh vật trên các đĩa thí nghiệm. Gọi A là số khuẩn lạc ở đĩa 1
Gọi B là số khuẩn lạc ở đĩa 2 Gọi C là số khuẩn lạc ở đĩa chứng
Nếu B ≈ A + C → mẫu thử không có chất ức chế.
Nếu B ≈ A hoặc B << A + C → mẫu thử có chất ức chế vi sinh vật. Chất ức chế phải đ−ợc xử lý bằng cách tăng thể tích môi tr−ờng, trung hoà chất ức chế bằng các chất trung hoà thích hợp nh− tween 20 4%. Nếu mẫu có chất ức chế quá mạnh phải thử bằng ph−ơng pháp màng lọc.
* Kiểm tra chất ức chế cũng có thể đ−ợc thực hiện theo cách sau:
Cấy khoảng 100 tế bào các vi khuẩn vào các ống môi tr−ờng chọn lọc không có mẫu thử và có mẫu thử ở nồng độ thích hợp cho E. coli Salmonella, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa.
Mẫu thử không có tác dụng ức chế nếu vi khuẩn mọc tốt nh− nhau ở cả hai ống môi tr−ờng.
Đếm số l−ợng vi sinh vật:
• (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
•
− Đối với vi khuẩn:
Cho vào mỗi đĩa petri 1ml chất thử ở nồng độ thích hợp sao cho không quá 300 khuẩn lạc trong 1ml. Thêm 15 - 20ml môi tr−ờng thạch casein - đậu t−ơng hoặc môi tr−ờng thạch th−ờng đã để nguội d−ới 45oC, xoay nhẹ đĩa để chất thử trộn đều vào môi tr−ờng. Nuôi cấy 30 - 350C trong 1 - 2 ngày. − Đối với vi nấm:
Cho vào mỗi đĩa petri 1ml chất thử ở nồng độ thích hợp sao cho không quá 100 khuẩn lạc vi nấm trong 1ml. Thêm 15-20ml thạch Sabouraud + kháng sinh.
− Nuôi cấy 25 - 28oC trong 4 - 5 ngày.
− Thí nghiệm đ−ợc thực hiện với 1 hay 2 nồng độ pha loãng cuối cùng. Mỗi nồng độ đ−ợc làm 2 - 3 đĩa thử để lấy giá trị trung bình. Sau thời gian nuôi cấy, các đĩa có số khuẩn lạc vi khuẩn nhỏ hơn 300 và vi nấm nhỏ hơn 100 đ−ợc đếm để tính số l−ợng.
Tính kết quả:
Tổng số vi khuẩn hiếu khí, vi nấm trong 1g (1ml) đ−ợc tính theo công thức:
2 k k A k A X 1 1 + 2 2 = (Phép thử thực hiện với 2 nồng độ).
A1 : Số khuẩn lạc vi sinh vật trung bình ở nồng độ pha loãng k1. A2 : Số khuẩn lạc vi sinh vật trung bình ở nồng độ pha loãng k2. k1, k2 : Độ pha loãng.
Các d−ợc điển có quy định: mẫu thử có ít hơn 10 vi sinh vật/1g (1ml) nếu không có khuẩn lạc mọc trên đĩa thử ở nồng độ 10-1.