C X chuẩn thêm vào
Kiểm nghiệm thuốc bằng ph−ơng pháp sinh học
4.3.5.3. Chủng chỉ thị
Chủng chỉ thị là chủng vi sinh vật thuần khiết, nhạy cảm đối với một chất kháng sinh, chủng chỉ thị th−ờng đ−ợc phân lập từ các bảo tàng giống Quốc gia, đ−ợc bảo quản trong ống đông khô hoặc trong môi tr−ờng thích hợp ở 4 - 10oC. Tuỳ theo d−ợc điển của mỗi n−ớc, mỗi chất kháng sinh có thể có một vài chủng chỉ thị khác nhau.
Chế tạo nhũ dịch vi sinh vật không có bào tử:
•
− Các chủng vi khuẩn:
Staphylococcus aureus Sarcina lutea
Escherichia coli Micrococcus luteus Klebsiella faecalis. − Chủng vi nấm:
Saccharomyces cerevisiae.
Đối với các chủng vi sinh vật không có bào tử, khi thử nghiệm cần sử dụng chủng sau 16 - 24 giờ nuôi cấy để đ−ợc các chủng chỉ thị đang ở giai đoạn phát triển logarit.
Chủng chỉ thị là vi khuẩn tr−ớc khi sử dụng đ−ợc cấy sang môi tr−ờng thạch dinh d−ỡng (pepton 10g, cao thịt 1,5g, cao men 3g, glucose 1g, thạch 15g, n−ớc cất 1000 ml). Sau 16 - 18 giờ nuôi cấy ở 35 - 37oC các vi khuẩn đ−ợc làm thành một nhũ dịch có nồng độ thích hợp với NaCl 0,9% để tạo vòng vô khuẩn rõ rệt trong ph−ơng pháp khuếch tán và có độ đục thích hợp trong ph−ơng pháp đo độ đục.
Chủng chị thị là vi nấm đ−ợc nuôi cấy trên môi tr−ờng thạch Sabouraud ở 28 - 30oC trong 24 giờ và cũng đ−ợc làm thành một nhũ dịch có nồng độ thích hợp. • • Chế tạo nhũ dịch bào tử: Các chủng chỉ thị có bào tử: Bacillus subtilis Bacillus pumilus Bacillus cereus
Nếu chủng chỉ thị có bào tử nên chế tạo dạng bào tử để sử dụng, vì dạng bào tử đ−ợc bảo quản d−ới 4oC có thể tồn tại trong một thời gian rất dài.
Các chủng vi khuẩn trên đ−ợc cấy vào bình môi tr−ờng thạch dinh d−ỡng có bề mặt thạch rộng (pepton 6g, cao thịt 1,5g, cao men 3g, glucose 1g, K2HPO4 3,68g, KH2PO4 1,32g, thạch 15g, n−ớc cất 1000ml)
Môi tr−ờng này đ−ợc thêm MnSO4 với hàm l−ợng 0,001g/lít để thúc đẩy sự hình thành bào tử. Nuôi cấy 35 - 37oC trong vòng 7 ngày với B. cereus nuôi cấy ở 30oC. Dùng n−ớc cất vô trùng rửa lớp bào tử trên bề mặt môi tr−ờng để tạo một nhũ dịch. Đun cách thủy nhũ dịch này 70oC/ 30 phút, pha loãng nhũ dịch đến nồng độ 107 - 108 bào tử trong 1ml.