3.1.1. Nguyên liệu
Nguyên liệu: Lá tía tô tươi, không bị sâu bệnh hay nấm mốc được thu mua ở các vườn rau tại Thành phố Buôn Ma Thuột, tỉnh Đắk Lắk.
Nguyên liệu lá tía tô được sử dụng ở 2 dạng: dạng tươi và dạng sấy khô.
Hình 3.1. Hình ảnh nguyên liệu dùng khảo sát
3.1.2. Hóa chất và thiết bị sử dụng trong quá trình nghiên cứu
3.1.2.1. Hóa chất
- Ethanol 99,5% - N-hexan
- Thuốc thử Folin-Ciocalteu, Dung dịch HCl 2%, hồ tinh bột 0,5%; dung dịch iod 0,001N.
-HCl tinh khiết; NaOH 1N, 0,1N; 30%, Phenolphtalein 1%; Pb(CH3COO)2 30%; Na2SO4 bão hòa; KMnO4 1/30N; thuốc thử Felling A, thuốc thử Felling B; dung dịch Fe2(SO4)3.
-Dung dịch H2SO4 đậm đặc, dung dịch K2SO4, dung dịch CuSO4, dung dịch H3BO3 3%, chất chỉ thị Tasiro, NaOH 40%, H2SO4 0,1N.
-Dung dịch HCl 2%, hồ tinh bột 0,5%; dung dịch iod 0,001N. -Môi trường PCA, SS-Agar, MacConkey Agar
3.1.2.2. Thiết bị sử dụng
- Bếp cách thủy
- Thiết bị cô quay chân không - Thiết bị ly tâm
- Quang phổ kế - Nồi thanh trùng - Tủ lạnh
- Tủ cấy vô trùng
- Dụng cụ: Đĩa petri; que cấy; đèn cồn; bình tam giác 100 ml; bình tam giác 250 ml; giấy lọc 0,5 cm; ống pipet 10 ml; pipetman 1000 µl….
3.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Xác định được một số chỉ tiêu ban đầu của nguyên liệu lá tía tô.
- Xác định được các yếu tốảnh hưởng đến quá trình thu nhận dịch chiết. - Đề xuất được quy trình thu nhận dịch chiết giàu hàm lượng polyphenol. - Xác định được các yếu tốảnh hưởng đến quá trình sản xuất nước giải khát từ dịch chiết lá tía tô.
- Đề xuất quy trình sản xuất nước giải khát từ dịch chiết lá tía tô. - Đánh giá chất lượng sản phẩm nước giải khát từ dịch chiết lá tía tô.
3.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.1. Phương pháp lấy mẫu
Việc lấy mẫu được thực hiện theo cảm quan là chủ yếu, chọn những lá không bị sâu bệnh, tươi tốt, sau khi phân loại lá tía tô được đem rửa sạch và để ráo làm nguyên liệu cho quá trình nghiên cứu. Nguyên liệu lựa chọn nghiên cứu theo tiêu chuẩn kỹ thuật quốc gia QCVN 01-28:2010/BNNPTNT gồm 01 búp với 3-4 lá non [26].
3.3.2. Phương pháp bố trí thí nghiệm
3.3.2.1. Bố trí thí nghiệm các yếu tốảnh hưởng đến quá trình trích ly dịch chiết
Trích ly là giai đoạn quan trọng ảnh hưởng rất lớn đến chất lượng dịch chiết thu nhận được, tôi tiến hành khảo sát một số yếu tốảnh hưởng đến quá trình trích ly trên đểđảm bảo hiệu suất thu hồi dịch chiết là cao.
Sơ đồ thí nghiệm được bốtrí như sau:
Hình 3.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm các yếu tốảnh hưởng đến quá trình trích ly dịch chiết
Đối với từng yếu tố ảnh hưởng, tôi thực hiện lần lượt các thí nghiệm: mỗi thí nghiệm tiến hành cân 1g nguyên liệu mỗi loại và dung môi cho vào bình tam giác, để thu dịch chiết có hiệu quả chiết xuất cao, tôi tiến hành khảo sát từng điều kiện ảnh hưởng đến quá trình trích ly như được trình bày ở mục 3.3.3.
Lá tía tô tươi
Xử lý nguyên liệu Sấy 50oC, 12 giờ
Trích ly
Dung môi
Lọc
Cô quay chân không 60oC Ly tâm 2000 v/p, 15 phút Dịch chiết lá tía tô Tỉ lệ NL/DM Nhiệt độ Thời gian
Lọc: sau khi trích ly xong dùng giấy lọc để lọc bớt cặn và cô quay để tách dung môi. Sau đó tiếp tục cho dịch chiết ly tâm 2000 v/p trong 15 phút để tách kiệt cặn còn sót lại.
Đo OD: dịch chiết thu được đem đi đo OD, đối với mỗi thí nghiệm hiệu quả chiết suất của nguyên liệu được tôi đánh giá qua hàm lượng hợp chất polyphenol đo được ởbước sóng 765nm bằng máy đo quang phổ kế.
3.3.3. Phương pháp trích ly dịch chiết
3.3.3.1. Khảo sát nguyên liệu trích ly (TN1)
Nguyên liệu là một trong những yếu tốảnh hưởng đến chất lượng dịch chiết thu nhận được. Tôi tiến hành thí nghiệm khảo sát chọn nguyên liệu tươi hay khô để thu nhận dịch chiết từ lá tía tô hiệu quả nhất.
Đối với nguyên liệu tươi, tiến hành xay thô để khảo sát, đối với nguyên liệu khô tiến hành sấy lá tươi ở nhiệt độ 50oC trong 12 giờ để đưa về độ ẩm an toàn (6-8%) trước khi khảo sát.
Thí nghiệm được tiến hành như sau: cân 1g lá tía tô tươi đã xay thô và 1g lá tía tô sấy khô đã nghiền nhỏ vào hai bình 120ml, đem đi trích ly với các yếu tốnhư sau:
Bảng 3.1. Khảo sát nguyên liệu trích ly
Loại nguyên liệu Yếu tố giảđịnh
Lá tía tô tươi Lá tía tô sấy khô
Dung môi: ethanol 99,5% Tỉ lệ nguyên liệu/ dung môi: 1/20
Nhiệt độ chiết: 65oC Thời gian chiết: 150 phút
Sau khi trích ly dịch được lọc qua giấy lọc, cô quay, ly tâm loại bỏ cặn rồi pha dịch chuẩn bịđo OD.
Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần, nguyên liệu nào sau khi trích ly cho hiệu quả cao nhất (tức giá trị OD cao nhất) sẽđược chọn làm nguyên liệu cho khảo sát tiếp theo.
3.3.3.2. Khảo sát dung môi trích ly (TN2)
Trong quá trình trích ly, lựa chọn dung môi thích hợp là hết sức quan trọng, đảm bảo vừa trích ly được nhiều nhất các chất mong muốn vừa đảm bảo các yêu cầu về kinh tế, sức khỏe, an toàn khi sử dụng trong nghiên cứu hay ứng dụng trong thực phẩm.
Tôi tiến hành khảo sát với 3 loại dung môi là Ethanol 99,5%, n-hexan và nước cất. * Ethanol: hay còn gọi là cồn, ancol etylic. Là một chất lỏng, không màu, trong suốt, mùi đặc trưng, vị cay, nhẹhơn nước, dễbay hơi, tan trong nước vô hạn, hút ẩm,
dễ cháy, khi cháy không có khói và ngọn lửa màu xanh da trời. Ethanol được xem là một trong những dung môi chiết tách tốt, thường được sử dụng rộng rãi và rẻ tiền
Công thức hóa học: C2H5OH Khối lượng phân tử : 46,07g/mol Tỷ trọng : 0,789g/cm3 Nhiệt độ sôi : 78,5oC
* N-hexan: là một hydrocacbon nhóm ankan, là chất lỏng không màu ở nhiệt độ phòng, n-hexan là dung môi không phân cực, dễ bay hơi và có mùi giống mùi xăng, chúng được sử dụng rộng rãi do giá cả phải chăng, tương đối an toàn và phần lớn trơ với các chất khác.
Công thức hóa học : C6H14 Khối lượng phân tử : 86,18g/mol Tỷ trọng : 0,6548g/cm3 Nhiệt độ sôi : 69oC
* Nước cất: là nước tinh khiết, nguyên chất, được điều chế bằng cách chưng cất. Nhiệt độ sôi 100oC, khối lượng phân tử 18g/mol. Nước được biết đến là dung môi rẻ tiền, an toàn khi sử dụng nên được ứng dụng khá rộng rãi.
Để tiến hành thí nghiệm, tôi cân 1g nguyên liệu đã khảo sát ở thí nghiệm 1 cho vào 3 bình 120ml, thêm vào 3 bình các loại dung môi cần khảo sát, trích ly dịch với các yếu tốnhư sau:
Bảng 3.2. Khảo sát dung môi trích ly
Dung môi Yếu tố giảđịnh
Ethanol 99,5% N-hexan Nước cất
Nguyên liệu: kết quảđạt được từ TN1. Tỉ lệ nguyên liệu/ dung môi: 1/20
Nhiệt độ chiết: 65oC Thời gian chiết: 150 phút
Sau khi trích ly dịch được lọc qua giấy lọc, cô quay, ly tâm loại bỏ cặn rồi pha dịch chuẩn bịđo OD. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần, dung môi cho giá trị OD trung bình cao nhất sẽđược chọn làm dung môi trích ly cho khảo sát tiếp theo.
3.3.3.3. Khảo sát nồng độ dung môi trích ly (TN3)
Sau khi chọn được dung môi thích hợp từ TN2, tôi tiến hành khảo sát nồng độ dung môi thích hợp cho quá trính trích ly, nếu kết quả từ thí nghệm 2 dung môi thích
hợp là nước cất thì thí nghiệm 3 này sẽ không cần tiến hành, ngược lại nếu dung môi thích hợp là n-hexan và ethanol 99,5% thì thí nghiệm 3 được tiến hành để khảo sát các nồng độtương ứng cho quá trính trích ly.
Để tiến hành thí nghiệm, tôi cân 1g lá tía tô cho vào bình 120ml đem trích ly với các yếu tốnhư sau:
Bảng 3.3. Khảo sát nồng độ dung môi trích ly
Nồng độ dung môi Yếu tố giảđịnh
Dung môi nguyên chất Dung môi 90% Dung môi 80% Dung môi 70% Nguyên liệu: kết quả từ TN1 Dung môi: kết quả từ TN2 Tỉ lệ NL/DM: 1/20 Nhiệt độ chiết: 65oC Thời gian chiết: 150 phút
Tương tự dịch sau khi trích ly được đem đi lọc, cô quay, ly tâm thu dịch chiết và đo OD, thí nghiệm được lặp lại 3 lần, nồng độ dung môi thích hợp được chọn cho khảo sát tiếp theo.
3.3.3.4. Khảo sát tỉ lệ nguyên liệu/dung môi (TN4)
Tỉ lệ nguyên liệu/ dung môi (NL/DM) là một yếu tố có ảnh hưởng đến quá trình trích ly. Để khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ NL/DM đến quá trình chiết, tôi tiến hành cố định lượng nguyên liệu cho vào và thay đổi lượng dung môi trích ly theo các tỉ lệ. Thí nghiệm được tiến hành như sau: cân 1g lá tía tô đã nghiền nhỏ cho vào bình 120ml, thêm vào trong bình một lượng dung môi cần khảo sát, rồi đem đi trích ly với các yếu tố cốđịnh và thay đổi như sau:
Bảng 3.4. Khảo sát tỉ lệ nguyên liệu/dung môi trích ly
Tỉ lệ nguyên liệu/dung môi Yếu tố giảđịnh
1/10 1/20 1/30 1/40 Nguyên liệu: kết quả từ TN1 Dung môi: kết quả từ TN2 Nồng độ dung môi: kết quả từ TN3 Nhiệt độ chiết: 65oC Thời gian chiết: 150 phút
Sau khi lọc dịch được đem đi lọc, cô quay, ly tâm, thu dịch chiết và đo OD, thí nghiệm được lặp lại 3 lần, giá trị trung bình cao nhất sẽ được chọn làm tỉ lệ nguyên liệu/ dung môi thích hợp cho khảo sát tiếp theo.
3.3.3.5. Khảo sát nhiệt độ trích ly (TN5)
Khảo sát nhiệt độ là cần thiết để đảm bảo dịch chiết thu nhận được có hiệu quả cao, hạn chế các tạp chất kéo theo vào trong dịch chiết, ảnh hưởng đến chất lượng dịch chiết.
Tiến hành thí nghiệm: cân 1g lá tía tô cho vào bình 120ml, thêm dung môi, bọc kín miệng bằng giấy bạc, cho vào bếp cách thủy ngâm chiết nóng với các mức nhiệt độ khảo sát trong 150 phút, các yếu tố trong thí nghiệm này như sau:
Bảng 3.5. Khảo sát nhiệt độ trích ly Nhiệt độ trích ly Yếu tố giảđịnh 55oC 60oC 65oC 70oC Nguyên liệu: kết quả từ TN1 Dung môi: kết quả từ TN2 Nồng độ dung môi: kết quả từ TN3 Tỉ lệ NL/DM: kết quả từ TN4 Thời gian chiết: 150 phút
Sau khi trích ly theo điều kiện trên, dịch được đem đi lọc, cô quay, ly tâm, thu dịch chiết và đo OD, thí nghiệm được lặp lại 3 lần, từ giá trịđo trung bình cao nhất sẽ chọn được nhiệt độ chiết thích hợp cho khảo sát tiếp theo.
3.3.3.6. Khảo sát thời gian trích ly (TN6)
Thời gian cũng là một yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly, để đánh giá tác động của chúng đến khảnăng thu nhận dịch chiết, tôi tiến hành khảo sát thời gian trích ly.
Bảng 3.6. Khảo sát thời gian trích ly
Thời gian trích ly Yếu tố giảđịnh 120 phút 150 phút 180 phút 210 phút Nguyên liệu: kết quả từ TN1 Dung môi: kết quả từ TN2 Nồng độ dung môi: kết quả từ TN3 Tỉ lệ NL/DM: kết quả từ TN4 Nhiệt độ chiết: kết quả từ TN5
Cân 1g nguyên liệu đã chọn từ thí nghiệm 1, cho vào các bình 120ml, thêm dung môi đã chọn được từ thí nghiệm 2 với nồng độ từ thí nghiệm 3, tỉ lệ NL/DM từ thí nghiệm 4 rồi đem bọc miệng bình bằng giấy bạc, chiết ở nhiệt độ từ thí nghiệm 5 trong thời gian khảo sát.
Sau thời gian trích ly, dịch được đem lọc đi lọc, cô quay, ly tâm, thu dịch chiết và đo OD, thí nghiệm được lặp lại 3 lần, giá trịđo trung bình cao nhất sẽđược chọn làm thời gian trích ly hiệu quả, đây là thí nghiệm cuối cùng để hoàn thiện quy trình thu nhận dịch chiết từ lá tía tô.
3.3.4. Bố trí thí nghiệm khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sản xuất nước giải khát từ dịch chiết lá tía tô nước giải khát từ dịch chiết lá tía tô
3.3.4.1. Khảo sát tỉ lệ đường bổ sung trong công thức phối chế nước giải khát từ
dịch chiết lá tía tô (TN7)
Bảng 3.7. Khảo sát tỉ lệ đường bổ sung
Tỷ lệđường bổ sung Yếu tố giảđịnh CT1: 8% CT2: 10% CT3: 12% CT4: 14% Acid citric: 0,2% Ascorbic acid: 0,05% Dịch chiết: 3% Carrageenan: 0,04%
Cách tiến hành: phối chế 4 mẫu có tỉ lệ đường bổ sung lần lượt là 8%, 10%, 12% và 14% tương ứng với các kí hiệu CT1, CT2, CT3 và CT4 cùng các tỉ lệ thành phần khác được cốđịnh.
Sau khi phối chế, các mẫu đều được thanh trùng ở nhiệt độ 80oC trong thời gian 10 phút và được đánh giá cảm quan, đo Bx để chọn được tỉ lệđường bổ sung. Kết quả ở thí nghiệm này được sử dụng trong các khảo sát tiếp theo.
Các mẫu được thực hiện trong cùng điều kiện. Thí nghiệm được tiến hành theo sơ đồ hình 2.1 (mục 2.1, phụ lục 2).
3.3.4.2. Khảo sát tỉ lệ acid citric bổ sung trong công thức phối chếnước giải khát từ
dịch chiết lá tía tô (TN8)
Bảng 3.8. Khảo sát tỉ lệ acid citric bổ sung
Tỉ lệ acid citric bổ sung Yếu tố giảđịnh
CT5: 0,1% CT6: 0,15% CT7: 0,2% CT8: 0,25% Đường: chọn ở TN7 Ascorbic acid: 0,05% Dịch chiết: 3 ml Carrageenan: 0,04%
Cách tiến hành: phối chế 4 mẫu có tỉ lệ acid citric bổ sung lần lượt là 0,1%, 0,15%, 0,2% và 0,25%, tương ứng với các kí hiệu CT5, CT6, CT7 và CT8 cùng các tỉ lệ thành phần khác được cốđịnh.
Sau khi phối chế, các mẫu đều được thanh trùng ở nhiệt độ 80oC trong thời gian 10 phút và được đánh giá cảm quan, đo pH để chọn được hàm lượng acid citric bổ sung. Kết quảở thí nghiệm này được sử dụng trong các khảo sát tiếp theo.
Các mẫu được thực hiện trong cùng điều kiện. Thí nghiệm được tiến hành theo sơ đồ hình 2.2 (mục 2.2, phụ lục 2).
3.3.4.3. Khảo sát tỉ lệ ascorbic acid bổ sung trong công thức phối chếnước giải khát từ dịch chiết lá tía tô (TN9)
Bảng 3.9. Khảo sát tỉ lệ acid ascorbic bổ sung
Tỉ lệ ascorbic acid bổ sung Yếu tố giảđịnh
CT9: 0,03% CT10: 0,05% CT11: 0,07% CT12: 0,09% Đường: chọn ở TN7 Acid citric: chọn ở TN8 Dịch chiết: 3 ml Carrageenan: 0,04%
Cách tiến hành: phối chế 4 mẫu có tỉ lệ ascorbic acid bổ sung lần lượt là 0,03%, 0,05%, 0,07% và 0,09%, tương ứng với các kí hiệu CT9, CT10, CT11 và CT12 cùng các tỉ lệ thành phần khác được cốđịnh.
Sau khi phối chế, các mẫu đều được thanh trùng ở nhiệt độ 800C trong thời gian 10 phút và được đánh giá cảm quan để chọn được hàm lượng ascorbic acid bổ sung. Kết quảở thí nghiệm này được sử dụng trong các khảo sát tiếp theo.
Các mẫu được thực hiện trong cùng điều kiện. Thí nghiệm được tiến hành theo sơ đồ hình 2.3 (mục 2.3, phụ lục 2).
3.3.4.4. Khảo sát tỉ lệ dịch chiết bổ sung trong công thức phối chếnước giải khát từ
dịch chiết lá tía tô (TN10)
Bảng 3.10. Khảo sát tỉ lệ dịch chiết bổ sung
Tỉ lệ dịch chiết bổ sung Yếu tố giảđịnh CT13: 2ml CT14: 3ml CT15: 4ml CT16: 5ml Đường: chọn ở TN7 Acid citric: chọn ở TN8 Ascorbic acid: chọn ở TN9 Carrageenan: 0,04%
Cách tiến hành: phối chế 4 mẫu có tỉ lệ dịch chiết bổ sung lần lượt là 2%, 3%, 4% và 5% tương ứng với các kí hiệu CT13, CT14, CT15 và CT16 cùng các tỉ lệ thành phần khác được cốđịnh.
Sau khi phối chế, các mẫu đều được thanh trùng ở nhiệt độ 80oC trong thời gian 10 phút và được đánh giá cảm quan để chọn được hàm lượng dịch chiết bổ sung. Kết quảở thí nghiệm này được sử dụng trong các khảo sát tiếp theo.
Các mẫu được thực hiện trong cùng điều kiện. Thí nghiệm được tiến hành theo