3.4.1. Phương pháp vật lý
3.4.1.1. Xác định độẩm bằng phương pháp sấy đến khối lượng không đổi
Nguyên tắc: Sấy mẫu ở nhiệt độ 105oC đến khối lượng không đổi. Chênh lệch khối lượng mẫu trước và sau khi sấy là lượng ẩm đã bay hơi.
Cách tiến hành: trình bày ở mục 1.1, phụ lục 1. Theo TCVN 1867:2001.
3.4.1.2. Xác định hàm lượng khoáng trong nguyên liệu
Nguyên tắc: Dùng nhiệt độ (530oC - 550oC) nung nóng hoàn toàn các chất hữu cơ có trong nguyên liệu. Phần tro còn lại chính là phần khoáng, đem cân trọng lượng sẽxác định được hàm lượng tro.
Cách tiến hành: trình bày ở mục 1.2, phụ lục 1. Theo TCVN 5105:2009.
3.4.2. Phương pháp hóa sinh
3.4.2.1. Xác định hàm lượng protein
Nguyên tắc: Xác định nitơ tổng bằng phương pháp Kjeldahl. Hàm lượng protein được tính bằng cách nhân lượng nitơ tổng với hệ sốquy đổi 6,25 [18]
Cách tiến hành: trình bày ở mục 1.3, phụ lục 1.
3.4.2.2. Xác định đường khử
Nguyên tắc: hàm lượng đường khử tổng số được xác định theo phương pháp Bertrand (TCVN 4594 – 88). Nguyên tắc của phương pháp này là dựa vào phản ứng oxy hóa giữa đường khử với ion kim loại trong môi trường có tính kiềm .[18]
Cách tiến hành: trình bày ở mục 1.4, phụ lục 1.
3.4.2.3. Xác định hàm lượng vitamin C
Nguyên tắc: Vitamin C có thể khử dung dịch iot. Dựa vào lượng iot bị khử bởi vitamin C có trong mẫu, ta tìm được hàm lượng vitamin C. [18]
Cách tiến hành: trình bày ở mục 1.5, phụ lục 1.
3.4.2.4. Xác định hàm lượng cellulose
Nguyên tắc: Định lượng cellulose dựa trên tính chất bền của cellulose đối với tác dụng của acid mạnh và kiềm mạnh, không bị phân hủy dưới tác dụng của acid yếu.
hơn đối với tác dụng của acid và kiềm nên bị oxy hóa và phân giải sau đó tan vào dung dịch sau khi xử lý nguyên liệu.
Cách tiến hành: trình bày ở mục 1.6, phụ lục 1. [18]
3.4.2.5. Xác định hàm lượng polyphenol
– Nguyên tắc: Các hợp chất polyphenol trong dịch chiết được xác định bằng phương phương pháp đo màu, dùng thuốc thử Folin – Ciocalteu. Thuốc thử này chứa chất oxy hóa là acid phospho – vonframic. Trong quá trình khử, các nhóm hydroxyl của phenol dễ bị oxy hóa, chất oxy hóa này sinh ra màu xanh có độ hấp thu cực đại ởbước sóng 765 nm. Căn cứvào cường độmàu đo được trên máy so màu và đồ thị chuẩn của acid gallic đểxác định hàm lượng polyphenol trong mẫu nghiên cứu. [20]
- Cách tiến hành: Được trình bày ở mục 1.7, phụ lục 1.
3.4.3. Phương pháp đánh giá cảm quan
Để lựa chọn các thông số sử dụng trong sản xuất như tỉ lệ nguyên liệu phối trộn (đường, acid citric…) tôi tiến hành đánh giá cảm quan từ các công thức trên bằng phép thử cho điểm thị hiếu để lựa chọn mẫu người tiêu dùng ưa thích nhất, mức thang điểm 9 [22].
Phiếu đánh giá cảm quan: trình bày ở mục 4.1, phụ lục 4.
3.4.4. Phương pháp vi sinh [16]
- Phương pháp xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí.
Cách tiến hành: trình bày ở sơ đồ 3.1, phụ lục 3 theo TCVN 5165:1990. - Phương pháp xác định tổng số Coliform
Cách tiến hành: trình bày ở sơ đồ 3.2, phụ lục 3 theo TCVN 4882:2001. - Phương pháp xác định E. coli
Cách tiến hành: trình bày ở sơ đồ 3.2, phụ lục 3 theo TCVN 4882:2001. - Phương pháp xác định Salmonella.
Cách tiến hành: trình bày ở mục 3.3, phụ lục 3 theo TCVN 4829:2005
3.4.5. Xử lý số liệu
Kết quả thí nghiệm được quản lý và xử lý trên phần mềm Excel, phân tích phương sai một nhân tố ANOVA (One-way ANOVA) và so sánh các giá trị trung bình bằng phương pháp Duncan với mức ý nghĩa trên 95% trên phần mềm thống kê SPSS Statistics 20.
PHẦN 4.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
4.1. KẾT QUẢ KHẢO SÁT MỘT SỐ CHỈTIÊU HÓA BAN ĐẦU CỦA LÁ TÍA TÔ
Việc xác định được các thành phần cơ bản ban đầu của nguyên liệu là vô cùng quan trọng. Không những đềra được các biện pháp bảo quản, phương pháp chế biến, mà còn đưa ra một số thông số công nghệ trong quá trình sản xuất nhằm đảm bảo chất lượng của sản phẩm và đạt hiệu quả kinh tế cao.
Qua phân tích, kết quảthu được như sau:
Bảng 4.1. Một số chỉ tiêu ban đầu của lá tía tô
STT Thành phần Đơn vị Hàm lượng 1 Độẩm % 88,07 ± 0,51 2 Protein % chất khô 3,69 ± 0,06 3 Glucid % chất khô 3,07 ± 0,04 4 Vitamin C mg% chất khô 10,18 ± 0,38 5 Tro % chất khô 10,07 ± 0,02 6 Cellulose % chất khô 11,14 ± 0,15
7 Polyphenol tổng mg GAE/g chất khô 16,32 ± 0,04
8 Hoạt tính chống ôxi hóa % 75,69 ± 1,2
Qua bảng 4.1, ta thấy rằng:
Độ ẩm ban đầu của nguyên liệu lá tía tô tươi khá cao khoảng 88,07%, với độ ẩm này chứng tỏ lượng nước có trong lá rất lớn. Đây chính là nguyên nhân làm quá trình hư hỏng nhanh diễn ra, khó khăn cho công tác bảo quản. Nước làm tăng các phản ứng sinh lí, sinh hóa trong nguyên liệu, làm héo do sựthoát hơi nước bề mặt từđó ảnh hưởng đến cấu trúc, trạng thái, giảm trọng lượng cũng như chất lượng nguyên liệu. Vì vậy, để chủ động nguồn nguyên liệu trong sản xuất nước giải khát, thuận tiện cho quá trình chế biến, tôi tiến hành làm giảm độ ẩm nguyên liệu xuống độ ẩm an toàn bằng phương pháp sấy.
Trong lá tía tô tươi chứa khoảng 3,69% hàm lượng protein; 10,18 mg% vitamin C, đây là những thành phần dinh dưỡng quan trọng của cơ thể. Tuy nhiên, các thành phần dễ bị biến tính bởi các tác nhân nhiệt độ và ánh sáng đặc biệt là vitamin C, vì vậy trong quá trình xử lí nguyên liệu cũng như chế biến, cần hạn chế ảnh hưởng của các tác nhân này. Trong phân tích này, kết quả hàm lượng protein và vitamin C tương đương, có phần cao hơn so với kết quả công bố về thành phần dinh dưỡng tía tô của Bộ Y tế Việt Nam [6]. Sự sai lệch nhỏ này có thể do sự khác nhau vềvùng đất trồng, giống cây hoặc điều kiện khí hậu.
Hàm lượng polyphenol trong dịch chiết lá tía tô khoảng 16,32% và hoạt tính chống oxi hóa khoảng 75,69%. Nó là một trong những hoạt chất tự nhiên có nhiều tác dụng như kháng viêm, kháng khuẩn, chống dịứng và lão hóa cho con người. Hoạt tính chống oxi hóa có tác dụng trong việc ngăn ngừa ung thư. Nhiều kết quả thử nghiệm cho thấy chế độ ăn giàu polyphenol sẽ làm hạn chế sự xuất hiện stress và nhiều bệnh liên quan. Ngoài ra, polyphenol còn có khảnăng bảo quản thực phẩm [17]. Tuy nhiên, hợp chất dễ bị oxy hóa ngoài không khí tạo hợp chất sẫm màu và vịđắng cho rau quả.
Ngoài ra, kết quả phân tích cho thấy, hàm lượng tro và cellulose trong lá tía tô khá cao 10,07% và 11,24% chứng tỏhàm lượng muối khoáng chứa trong nguyên liệu nhiều và hàm lượng chất xơ cao có tác dụng tốt cho hệ tiêu hóa.
4.2. KHẢO SÁT QUY TRÌNH THU NHẬN DỊCH CHIẾT TỪ LÁ TÍA TÔ 4.2.1. Khảo sát nguyên liệu 4.2.1. Khảo sát nguyên liệu
Nguyên liệu là một trong các yếu tố có ảnh hưởng đến quá trình trích ly, tôi sử dụng 02 loại nguyên liệu để khảo sát là lá tía tô tươi và lá tía tô đã sấy khô, các bước tiến hành đã được trình bày ở mục 3.3.3.1.
Tiến hành thí nghiệm với khảo sát nguyên liệu tươi đem xay thô và nguyên liệu khô sấy ở 50oC trong 12 giờ. Kết quảthu được là giá trị trung bình của 3 lần lặp và kết quảđo OD được thể hiện ở bảng sau:
Bảng 4.2. Kết quả đo OD để lựa chọn nguyên liệu nghiên cứu
Dạng nguyên liệu OD765nm
Lá tươi 1,341a
Lá khô 1,292a
(Chữ cái a thể hiện sự không sai khác có ý nghĩa về mặt thống kê với p=0,05)
Kết quả từ bảng 4.2 cho thấy chiết bằng nguyên liệu tươi cho hàm lượng polyphenol cao hơn so với nguyên liệu khô, giá trịOD đo được của nguyên liệu tươi là
1,341; nguyên liệu khô là 1,292. Điều này có thể giải thích do nguyên liệu khô khi sấy đã bị thất thoát một phần các hợp chất không bền với nhiệt, hợp chất polyphenol khi sấy có thể bị thất thoát một phần nên hàm lượng polyphenol thu được thấp hơn so với nguyên liệu tươi. Tuy nhiên về ý nghĩa thống kê kết quả giữa chúng không có sự khác nhau ở mức ý nghĩa. Ngoài ra, đểđảm bảo tính đồng nhất của nguyên liệu và chủđộng được nguồn nguyên liệu cho việc nghiên cứu, tôi lựa chọn lá tía tô khô để làm nguyên liệu cho các khảo sát tiếp theo.
4.2.2. Khảo sát dung môi
Lựa chọn dung môi trích ly cần xem xét đến các chỉ tiêu kinh tế, an toàn đồng thời phải đem lại hiệu quả trích ly cao nhất. Dung môi có ảnh hưởng lớn đến quá trình trích ly, một số yếu tố của dung môi có thể ảnh hưởng đến quá trình trích ly như độ phân cực, độ nhớt hay sức căng bề mặt.
Tôi tiến hành khảo sát với 3 loại dung môi là ethanol 99,5%, n-hexan và nước cất. Các bước tiến hành thí nghiệm được trình bày ở mục 3.3.3.2, kết quả thu được là giá trị trung bình của 3 lần lặp và được thể hiện trong hình 4.1 và hình ảnh dịch chiết bằng các loại dung môi khảo sát được thể hiện ở hình 4.2.
Hình 4.1. Biểu đồ biểu diễn sự phụ thuộc của giá trị OD vào dung môi trích ly (Các chữ cái a, b thể hiện sự sai khác có ý nghĩa về mặt thống kê với p=0,05)
Hình 4.2. Dịch chiết bằng các loại dung môi
Ghi chú: 1. Dịch chiết bằng nước cất, 2. Dịch chiết bằng N-hexan, 3. Dịch chiết bằng ethanol 99,5%
Từ kết quả trên ta có thể thấy hiệu quả tách chiết đối với các loại dung môi khác nhau cho hàm lượng polyphenol đo được là khác nhau, kết quả thu được hàm lượng polyphenol có giá trị cao nhất đối với dung môi ethanol 99,5%, tiếp theo là nước cất và thấp nhất đối với n-hexan, tương ứng với kết quảđo là 1,215; 0,488 và 0,133.
Điều này có thể giải thích dựa vào sự phụ thuộc các tính chất của dung môi đó là: độ phân cực của dung môi, độ nhớt, sức căng bề mặt của dung môi. Tuy nhiên trong trường hợp này độ phân cực của dung môi thể hiện rõ hơn. Tính chất này nói đến khả năng hòa tan của dung môi đối với các cấu tử của nguyên liệu, dung môi ít phân cực thì dễ hòa tan các chất không phân cực và khó hòa tan các chất có nhiều nhóm phân cực. Ngược lại, dung môi phân cực mạnh thì dễ hòa tan các chất có nhiều nhóm phân cực và khó hòa tan các chất ít phân cực. Trong 3 loại dung môi khảo sát trên ta có n-hexan là dung môi không phân cực, trong khi đó nước và ethanol là các loại dung môi phân cực. Qua đây có thể thấy, các hợp chất polyphenol thu nhận được trong lá tía tô thuộc loại phân cực nên cho giá trịđo OD cao đối với Ethanol và nước.
Theo kết quả công bố của Nguyễn Thị Hoàng Lan và cộng sự (2014), nghiên cứu về trích ly tinh dầu từ lá tía tô đối với các loại dung môi ethanol 96%, N-hexan, etyl acetat và dicloetan thì ethanol 96% cho hiệu suất trích ly tinh dầu từ lá tía tô cao nhất [9]. Theo Nguyễn Bảo Lộc và cộng sự (2016) công bố nghiên cứu vềảnh hưởng dung môi đến khả năng trích ly một số hợp chất có hoạt tính sinh học từ lá nha đam, tác giả cũng chọn ethanol là dung môi trích ly [13]. Lựa chọn này cũng phù hợp với kết quả tôi thu nhận được, kết hợp với hình ảnh của các dịch chiết bởi ba loại dung
2 3
môi khác nhau từ hình 4.2, số liệu thu được từ hình 4.1 và từ những lập luận trên, tôi chọn ethanol làm dung môi trích ly trong nghiên cứu của mình.
4.2.3. Khảo sát nồng độ dung môi
Sau khi chọn dung môi, tôi tiến hành khảo sát nồng độdung môi đã lựa chọn để đánh giá ảnh hưởng của chúng đến quá trình thu nhận dịch chiết từ lá tía tô. Trong nghiên cứu này tôi tiến hành khảo sát ethanol ở các nồng độ 99,5%, 90%, 80% và 70% để thu nhận dịch chiết từ lá tía tô.
Tương tự như các thí nghiệm trước, dịch sau khi trích ly được đem lọc sạch, tiến hành đo OD ở bước sóng 765nm, kết quảthu được là giá trị trung bình của 3 lần lặp và được thể hiện ở hình 4.3, hình ảnh dịch chiết thu được khi trích ly bằng các nồng độ ethanol khác nhau được thể hiện ở hình 4.4.
(Các chữ cái a, b, c, d thể hiện sự sai khác có ý nghĩa về mặt thống kê với
p=0,05)
Hình 4.4. Dịch chiết bằng nồng độ dung môi khác nhau
Kết quả hình 4.3 cho thấy rằng khi tăng nồng độ ethanol từ70% đến 80% hàm lượng polyphenol có xu hướng tăng. Tuy nhiên khi tăng nồng độ ethanol lên 90% thì có xu hướng giảm. Cụ thểở Ethanol có nồng độ 80% cho giá trị polyphenol cao nhất với 1,633. Kết quả này có sựtương đồng với nghiên cứu của Nguyễn Bảo Lộc và cộng sự (2016) vềảnh hưởng của nồng độ dung môi đến khảnăng trích ly một số hợp chất có hoạt tính sinh học từ lá nha đam, nhận thấy hàm lượng anthraquinone trong dịch sau trích ly tăng tuyến tính với sựgia tăng nồng độ ethanol từ40% đến 80% nhưng khi tăng lên 96% lại giảm xuống [13]. Bên cạnh đó cũng có sự tương đồng với nhận định của Phạm Ngọc Khôi và cộng sự (2016), trích ly dịch từ nguyên liệu bắp cải tím sử dụng Ethanol ở các nồng độ khác nhau (99,5%, 90%, 80%, 70%, 60% và 50%) kết quả tổng hàm lượng polyphenol đạt thấp nhất ở Ethanol 96% là 0,105+0,003 (mgGAE/gdb) [7]. Tuy nhiên, lại khác với nhận định nghiên cứu của Nguyễn Thị Hoàng Lan và cộng sự (2014), khi tác giả sử dụng ethanol 96% được sử dụng để làm dung môi trích ly tinh dầu từ lá tía tô, tác giả lý giải với nồng độ 96% thì khả năng trích ly và bay hơi lượng tinh dầu từ lá tía tô là cao nhất [9]. Trong nghiên cứu này tôi cần trích ly thu nhận hàm lượng polyphenol cao nhất. So sánh với các kết quảđã được công bố của nhóm tác giả Nguyễn Bảo Lộc và Phạm Ngọc Khôi, tôi chọn nồng độ ethanol 80% để tiến hành cho các thí nghiệm tiếp theo.
4.2.4. Kết quả khảo sát tỉ lệ nguyên liệu/dung môi
Tỉ lệ nguyên liệu/dung môi cũng là một trong những yếu tốảnh hưởng đến hiệu quả trích ly dịch chiết. Sử dụng càng nhiều dung môi để trích ly, khả năng trích ly polyphenol trong lá tía tô càng lớn nhưng đến một mức nào đó nếu tăng lượng dung môi thì hiệu suất thu nhận polyphenol trong lá không tăng đáng kể, lúc đó việc trích ly sẽ không còn hiệu quả, sẽ vừa tốn dung môi, tốn thời gian và năng lượng đểđuổi dung môi. Tỉ lệ này tùy thuộc vào đặc tính hòa tan của hợp chất polyphenol trong dịch chiết đối với từng lượng dung môi khảo sát. Do đó, việc khảo sát tỉ lệ nguyên liệu/ dung môi là cần thiết để đảm bảo việc trích ly polyphenol trong lá tía tô thu được là cao nhất, đồng thời vừa đảm bảo tính kinh tế khi sử dụng.
Đểđánh giá ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu/dung môi đến quá trình trích ly, tôi tiến hành khảo sát trên một số tỉ lệ, bằng cách cốđịnh lượng nguyên liệu là 1g và thay đổi lượng dung môi cho vào. Theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Hoàng Lan và cộng sự (2014), tỉ lệ nguyên liệu/dung môi là 1/20 sẽ cho hiệu suất trích ly tinh dầu từ lá tía tô cao nhất [9]. Cũng theo nghiên cứu của Yu Jia và Li Xiuzhi (2017), cho thấy tỉ lệ giữa nguyên liệu/ dung môi là 1/40 cho dịch chiết từ lá tía tô hiệu quảđể bổ sung vào trong các chế phẩm kháng khuẩn và trong chất tẩy rửa [53]. Do đó, Tôi tiến hành khảo sát với các tỉ lệnhư sau: 1/10, 1/20, 1/30 và 1/40.
Kết quảthu được là giá trị trung bình của 3 lần lặp và được thể hiện trong hình