4.2.1. Khảo sát nguyên liệu
Nguyên liệu là một trong các yếu tố có ảnh hưởng đến quá trình trích ly, tôi sử dụng 02 loại nguyên liệu để khảo sát là lá tía tô tươi và lá tía tô đã sấy khô, các bước tiến hành đã được trình bày ở mục 3.3.3.1.
Tiến hành thí nghiệm với khảo sát nguyên liệu tươi đem xay thô và nguyên liệu khô sấy ở 50oC trong 12 giờ. Kết quảthu được là giá trị trung bình của 3 lần lặp và kết quảđo OD được thể hiện ở bảng sau:
Bảng 4.2. Kết quả đo OD để lựa chọn nguyên liệu nghiên cứu
Dạng nguyên liệu OD765nm
Lá tươi 1,341a
Lá khô 1,292a
(Chữ cái a thể hiện sự không sai khác có ý nghĩa về mặt thống kê với p=0,05)
Kết quả từ bảng 4.2 cho thấy chiết bằng nguyên liệu tươi cho hàm lượng polyphenol cao hơn so với nguyên liệu khô, giá trịOD đo được của nguyên liệu tươi là
1,341; nguyên liệu khô là 1,292. Điều này có thể giải thích do nguyên liệu khô khi sấy đã bị thất thoát một phần các hợp chất không bền với nhiệt, hợp chất polyphenol khi sấy có thể bị thất thoát một phần nên hàm lượng polyphenol thu được thấp hơn so với nguyên liệu tươi. Tuy nhiên về ý nghĩa thống kê kết quả giữa chúng không có sự khác nhau ở mức ý nghĩa. Ngoài ra, đểđảm bảo tính đồng nhất của nguyên liệu và chủđộng được nguồn nguyên liệu cho việc nghiên cứu, tôi lựa chọn lá tía tô khô để làm nguyên liệu cho các khảo sát tiếp theo.
4.2.2. Khảo sát dung môi
Lựa chọn dung môi trích ly cần xem xét đến các chỉ tiêu kinh tế, an toàn đồng thời phải đem lại hiệu quả trích ly cao nhất. Dung môi có ảnh hưởng lớn đến quá trình trích ly, một số yếu tố của dung môi có thể ảnh hưởng đến quá trình trích ly như độ phân cực, độ nhớt hay sức căng bề mặt.
Tôi tiến hành khảo sát với 3 loại dung môi là ethanol 99,5%, n-hexan và nước cất. Các bước tiến hành thí nghiệm được trình bày ở mục 3.3.3.2, kết quả thu được là giá trị trung bình của 3 lần lặp và được thể hiện trong hình 4.1 và hình ảnh dịch chiết bằng các loại dung môi khảo sát được thể hiện ở hình 4.2.
Hình 4.1. Biểu đồ biểu diễn sự phụ thuộc của giá trị OD vào dung môi trích ly (Các chữ cái a, b thể hiện sự sai khác có ý nghĩa về mặt thống kê với p=0,05)
Hình 4.2. Dịch chiết bằng các loại dung môi
Ghi chú: 1. Dịch chiết bằng nước cất, 2. Dịch chiết bằng N-hexan, 3. Dịch chiết bằng ethanol 99,5%
Từ kết quả trên ta có thể thấy hiệu quả tách chiết đối với các loại dung môi khác nhau cho hàm lượng polyphenol đo được là khác nhau, kết quả thu được hàm lượng polyphenol có giá trị cao nhất đối với dung môi ethanol 99,5%, tiếp theo là nước cất và thấp nhất đối với n-hexan, tương ứng với kết quảđo là 1,215; 0,488 và 0,133.
Điều này có thể giải thích dựa vào sự phụ thuộc các tính chất của dung môi đó là: độ phân cực của dung môi, độ nhớt, sức căng bề mặt của dung môi. Tuy nhiên trong trường hợp này độ phân cực của dung môi thể hiện rõ hơn. Tính chất này nói đến khả năng hòa tan của dung môi đối với các cấu tử của nguyên liệu, dung môi ít phân cực thì dễ hòa tan các chất không phân cực và khó hòa tan các chất có nhiều nhóm phân cực. Ngược lại, dung môi phân cực mạnh thì dễ hòa tan các chất có nhiều nhóm phân cực và khó hòa tan các chất ít phân cực. Trong 3 loại dung môi khảo sát trên ta có n-hexan là dung môi không phân cực, trong khi đó nước và ethanol là các loại dung môi phân cực. Qua đây có thể thấy, các hợp chất polyphenol thu nhận được trong lá tía tô thuộc loại phân cực nên cho giá trịđo OD cao đối với Ethanol và nước.
Theo kết quả công bố của Nguyễn Thị Hoàng Lan và cộng sự (2014), nghiên cứu về trích ly tinh dầu từ lá tía tô đối với các loại dung môi ethanol 96%, N-hexan, etyl acetat và dicloetan thì ethanol 96% cho hiệu suất trích ly tinh dầu từ lá tía tô cao nhất [9]. Theo Nguyễn Bảo Lộc và cộng sự (2016) công bố nghiên cứu vềảnh hưởng dung môi đến khả năng trích ly một số hợp chất có hoạt tính sinh học từ lá nha đam, tác giả cũng chọn ethanol là dung môi trích ly [13]. Lựa chọn này cũng phù hợp với kết quả tôi thu nhận được, kết hợp với hình ảnh của các dịch chiết bởi ba loại dung
2 3
môi khác nhau từ hình 4.2, số liệu thu được từ hình 4.1 và từ những lập luận trên, tôi chọn ethanol làm dung môi trích ly trong nghiên cứu của mình.
4.2.3. Khảo sát nồng độ dung môi
Sau khi chọn dung môi, tôi tiến hành khảo sát nồng độdung môi đã lựa chọn để đánh giá ảnh hưởng của chúng đến quá trình thu nhận dịch chiết từ lá tía tô. Trong nghiên cứu này tôi tiến hành khảo sát ethanol ở các nồng độ 99,5%, 90%, 80% và 70% để thu nhận dịch chiết từ lá tía tô.
Tương tự như các thí nghiệm trước, dịch sau khi trích ly được đem lọc sạch, tiến hành đo OD ở bước sóng 765nm, kết quảthu được là giá trị trung bình của 3 lần lặp và được thể hiện ở hình 4.3, hình ảnh dịch chiết thu được khi trích ly bằng các nồng độ ethanol khác nhau được thể hiện ở hình 4.4.
(Các chữ cái a, b, c, d thể hiện sự sai khác có ý nghĩa về mặt thống kê với
p=0,05)
Hình 4.4. Dịch chiết bằng nồng độ dung môi khác nhau
Kết quả hình 4.3 cho thấy rằng khi tăng nồng độ ethanol từ70% đến 80% hàm lượng polyphenol có xu hướng tăng. Tuy nhiên khi tăng nồng độ ethanol lên 90% thì có xu hướng giảm. Cụ thểở Ethanol có nồng độ 80% cho giá trị polyphenol cao nhất với 1,633. Kết quả này có sựtương đồng với nghiên cứu của Nguyễn Bảo Lộc và cộng sự (2016) vềảnh hưởng của nồng độ dung môi đến khảnăng trích ly một số hợp chất có hoạt tính sinh học từ lá nha đam, nhận thấy hàm lượng anthraquinone trong dịch sau trích ly tăng tuyến tính với sựgia tăng nồng độ ethanol từ40% đến 80% nhưng khi tăng lên 96% lại giảm xuống [13]. Bên cạnh đó cũng có sự tương đồng với nhận định của Phạm Ngọc Khôi và cộng sự (2016), trích ly dịch từ nguyên liệu bắp cải tím sử dụng Ethanol ở các nồng độ khác nhau (99,5%, 90%, 80%, 70%, 60% và 50%) kết quả tổng hàm lượng polyphenol đạt thấp nhất ở Ethanol 96% là 0,105+0,003 (mgGAE/gdb) [7]. Tuy nhiên, lại khác với nhận định nghiên cứu của Nguyễn Thị Hoàng Lan và cộng sự (2014), khi tác giả sử dụng ethanol 96% được sử dụng để làm dung môi trích ly tinh dầu từ lá tía tô, tác giả lý giải với nồng độ 96% thì khả năng trích ly và bay hơi lượng tinh dầu từ lá tía tô là cao nhất [9]. Trong nghiên cứu này tôi cần trích ly thu nhận hàm lượng polyphenol cao nhất. So sánh với các kết quảđã được công bố của nhóm tác giả Nguyễn Bảo Lộc và Phạm Ngọc Khôi, tôi chọn nồng độ ethanol 80% để tiến hành cho các thí nghiệm tiếp theo.
4.2.4. Kết quả khảo sát tỉ lệ nguyên liệu/dung môi
Tỉ lệ nguyên liệu/dung môi cũng là một trong những yếu tốảnh hưởng đến hiệu quả trích ly dịch chiết. Sử dụng càng nhiều dung môi để trích ly, khả năng trích ly polyphenol trong lá tía tô càng lớn nhưng đến một mức nào đó nếu tăng lượng dung môi thì hiệu suất thu nhận polyphenol trong lá không tăng đáng kể, lúc đó việc trích ly sẽ không còn hiệu quả, sẽ vừa tốn dung môi, tốn thời gian và năng lượng đểđuổi dung môi. Tỉ lệ này tùy thuộc vào đặc tính hòa tan của hợp chất polyphenol trong dịch chiết đối với từng lượng dung môi khảo sát. Do đó, việc khảo sát tỉ lệ nguyên liệu/ dung môi là cần thiết để đảm bảo việc trích ly polyphenol trong lá tía tô thu được là cao nhất, đồng thời vừa đảm bảo tính kinh tế khi sử dụng.
Đểđánh giá ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu/dung môi đến quá trình trích ly, tôi tiến hành khảo sát trên một số tỉ lệ, bằng cách cốđịnh lượng nguyên liệu là 1g và thay đổi lượng dung môi cho vào. Theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Hoàng Lan và cộng sự (2014), tỉ lệ nguyên liệu/dung môi là 1/20 sẽ cho hiệu suất trích ly tinh dầu từ lá tía tô cao nhất [9]. Cũng theo nghiên cứu của Yu Jia và Li Xiuzhi (2017), cho thấy tỉ lệ giữa nguyên liệu/ dung môi là 1/40 cho dịch chiết từ lá tía tô hiệu quảđể bổ sung vào trong các chế phẩm kháng khuẩn và trong chất tẩy rửa [53]. Do đó, Tôi tiến hành khảo sát với các tỉ lệnhư sau: 1/10, 1/20, 1/30 và 1/40.
Kết quảthu được là giá trị trung bình của 3 lần lặp và được thể hiện trong hình 4.5, hình ảnh dịch chiết thu được khi trích ly bằng các tỉ lệ nguyên liệu/ dung môi khảo sát (1/10, 1/20, 1/30 và 1/40) được thể hiện trong hình 4.6.
(Các chữ cái a, b thể hiện sự sai khác có ý nghĩa về mặt thống kê với p=0,05)
Hình 4.6. Dịch chiết thu được khi khảo sát 4 tỉ lệ trích ly
Từ biểu đồ trên, ta có thể thấy tỉ lệ 1/30 hiệu suất trích ly polyphenol là cao nhất, tiếp đó là 1/40, 1/20 và thấp nhất là 1/10, tương ứng với các giá trị đo được là 1,887; 1,816; 1,583 và 1,161. Như vậy, lượng dung môi càng lớn khả năng trích ly polyphenol càng cao và ngược lại. Tuy nhiên, giá trị này chỉ tăng đến một giới hạn nhất định, ở tỉ lệ nguyên liệu/dung môi là 1/30 giá trịOD đo được là 1,887 nếu tiếp tục tăng lượng dung môi trích ly đến 1/40 hàm lượng polyphenol có giảm nhưng về ý nghĩa thống kê, chúng không có sự sai khác ở mức ý nghĩa p=0,05, việc tăng lượng dung môi sẽ vừa gây tốn kém, vừa tốn thời gian cho việc loại bỏ dung môi sau này. Vì vây, tỉ lệ1/30 được lựa chọn đểthu được giá trị polyphenol từ lá tía tô là thích hợp.
4.2.5. Kết quả khảo sát nhiệt độ trích ly
Nhiệt độ trích ly là một trong những yếu tố liên quan đến việc biến đổi các thành phần cần tách chiết cũng như việc bay hơi của các dung môi. Do đó, việc chọn được nhiệt độ chiết thích hợp là rất quan trọng, nếu nhiệt độ thấp không đủđể trích ly hợp chất polyphenol có trong lá, nhiệt độ cao thì độ hòa tan các chất sẽtăng nhưng kéo theo đó các tạp chất cũng hòa tan vào dịch và nếu nhiệt độ cao sẽ phá hủy các hợp chất kém bền, cũng như việc trích ly không có hiệu quả do dung môi chưa kịp trích ly đã bay hơi. Vì thế, cần khảo sát để chọn nhiệt độ chiết thích hợp để thỏa mãn các yêu cầu trên. Tôi tiến hành khảo sát nhiệt độ trích ly ở các mức nhiệt 55oC, 60oC, 65oC và 70oC [9], [19].
Kết quảthu được là giá trị trung bình của 3 lần lặp và được thể hiện trong hình 4.7, hình ảnh dịch chiết thu nhận được khi trích ly ở các mức nhiệt khảo sát (55oC, 60oC, 65oC và 70oC) thể hiện ở hình 4.8.
1/20 1/30 1/40
Hình 4.7. Biểu đồ biểu diễn sự phụ thuộc của giá trị OD vào nhiệt độ trích ly (Các chữ cái a, b thể hiện sự sai khác có ý nghĩa về mặt thống kê với p=0,05)
Hình 4.8. Dịch chiết thu được khi khảo sát nhiệt độ trích ly
Từ kết quả trên ta có thể thấy khi tăng nhiệt độ, hàm lượng polyphenol trích ly được càng nhiều, ở 70oC hiệu suất trích ly là cao nhất với giá trị OD765nm là 1,943; giá trị này giảm dần khi giảm nhiệt độ, cụ thểở 65oC là 1,903; 60oC là 1,501 và ở 55oC là 1,382. Điều này được giải thích như sau: bản chất của quá trình trích ly là khuếch tán, vì vậy khi tăng nhiệt độ quá trình khuếch tán sẽ được tăng cường, độ nhớt giảm, làm
70oC 65oC
60oC 55oC
cộng sự có sự sai khác, 60oC là nhiệt độ thích hợp để trích ly tinh dầu từ lá tía tô thấp hơn nhiệt độ tôi khảo sát được [9], tuy nhiên tương đồng với công bố của Yu Jia và Li Xiuzhi (2014), tác giả chiết xuất dịch lá tía tô ở nhiệt độ 65oC đến 70oC để bổ sung vào các chế phẩm kháng khuẩn và chất tẩy rửa [53] và Trần Hoàng Quyên về công trình nghiên cứu công nghệ sản xuất chế phẩm dịch chiết lá tía tô giàu acid rosmarinic để ứng dụng trong sản xuất đồ uống chức năng [19], tác giả cũng chọn 65-70oC là nhiệt độ trích ly dịch chiết lá tía tô.
Giá trị OD765nm ở 65oC và 70oC không có sự sai khác có ý nghĩa về mặt thống kê. Ngoài ra ở nhiệt độ 70oC có thể làm biến tính một số thành phần hợp chất polyphenol. Từ những lập luận trên, tôi lựa chọn 65oC để làm nhiệt độ khảo sát cho thí nghiệm tiếp theo.
4.2.6. Kết quả khảo sát thời gian trích ly
Thời gian cũng là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến quá trình trích ly các chất trong lá, quá trình trích ly cần có thời gian hợp lý đủđể trích ly tối đa các chất cần thiết. Tôi tiến hành khảo sát ở các mức thời gian là 120 phút, 150 phút, 180 phút và 210 phút
Kết quảthu được là giá trị trung bình của 3 lần lặp và được thể hiện trong hình 4.9 và hình ảnh dịch chiết thu nhận được khi trích ly ở các mức thời gian khác nhau được thể hiện ở hình 4.10.
Hình 4.9. Biểu đồ biểu diễn sự phụ thuộc của giá trị OD vào thời gian trích ly
Hình 4.10. Dịch chiết thu được khi khảo sát thời gian trích ly
Từ kết quả ở trên ta có thể, thời gian càng dài giá trị OD đo được càng cao nhưng đến một giới hạn nhất định giá trịnày có xu hướng giảm. Cụ thểở 120 phút giá trịOD đo được là 1,401; kéo dài đến 150 phút thì giá trịnày tăng lên 1,932; cao nhất ở 180 phút với giá trịđo OD là 2,391; sau đó giảm xuống 2,125 ở210 phút. Điều này có thể giải thích các hợp chất polyphenol có thời gian trích ly ra dịch càng nhiều khi kéo dài thời gian trích ly, nhưng đến một lúc nào đó hàm lượng polyphenol giảm xuống do trích ly trong thời gian dài khiến nó bị thất thoát một phần nào đó. Kết quảtrên tương đồng với công bố của Yu Jia và Li Xiuzhi (2014), thời gian chiết lá tía tô thích hợp từ 2 giờ đến 3 giờ cho dịch chiết có chất lượng cao nhất để bổ sung vào các chế phẩm kháng khuẩn và chất tẩy rửa [28].
Xét về mặt giá trị kinh tế cũng như giá trịdinh dưỡng từ dịch chiết mang lại, tôi chọn 180 phút làm thời gian trích ly dịch chiết từ lá tía tô.
* Nhận xét: Để thu nhận dịch chiết có hàm lượng polyphenol cao, tôi tiến hành trích ly ở dung môi ethanol có nồng độ 80%, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi là 1/30 và nhiệt độ, thời gian trích ly là 650C và 180 phút.
4.3. ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH THU NHẬN DỊCH CHIẾT TỪ LÁ TÍA TÔ QUY MÔ PHÒNG THÍ NGHIỆM MÔ PHÒNG THÍ NGHIỆM
4.3.1. Quy trình thu nhận dịch chiết từ lá tía tô
Dựa trên quy trình sơ bộ đã được đề xuất ở mục 3.3.2.1, qua quá trình khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly dịch chiết, tôi đề xuất quy trình thu nhận dịch chiết từlá tía tô như sau:
210 phút 180 phút 150 phút 120 phút Xử lý nguyên liệu Sấy 50oC, 12 giờ Lá tía tô
Hình 4.11. Sơ đồ quy trình thu nhận dịch chiết từ lá tía tô
4.3.2. Thuyết minh quy trình thu nhận dịch chiết từ lá tía tô
Nguyên liệu: nguyên liệu thu hái lựa chọn không có sâu bệnh hại, nấm mốc… theo tiêu chuẩn kỹ thuật quốc gia QCVN 01-28:2010/BNNPTNT [26]
Xử lí: sau khi thu hái vềđược phân loại, làm sạch tránh nhiễm đất cát, rác..; rửa