Phương pháp miễn dịch
Phƣơng pháp thử nghiệm hấp phụ miễn dịch gắn enzym (ELISA) cũng đƣợc sử dụng ngày càng rộng rãi và quan trọng hơn trong nghiên cứu, chẩn đốn và xét nghiệm do nó có độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Phƣơng pháp này đã đƣợc phát triển ở quy mô thƣơng mại và đƣợc sử dụng để phát hiện một số tác nhân gây bệnh phát sinh từ thực phẩm và độc tố của chúng gồm Salmonella, L. monocytogenes, C. jejuni. Minnich đã
sử dụng IgG kháng lại kháng nguyên roi của Salmonella Typhimurium để phát hiện Salmonella hay việc sử dụng enzym đánh dấu bằng avidin – biotin đã phát hiện đƣợc Salmonella trong các mẫu thực phẩm với giới hạn 25CFU/g. Tuy nhiên phƣơng pháp
ELISA thông thƣờng chỉ phát hiện đƣợc vi khuẩn trong mẫu thực phẩm với nồng độ 104 – 106 CFU/ml (g) do vậy vẫn cần phải có bƣớc tăng sinh trƣớc khi phân tích.
Kỹ thuật khuếch đại phản ứng polymerase (PCR)
PCR là phản ứng có sự tham gia của các enzym nhằm khuếch đại một đoạn axit nucleic mong muốn. Đây là một kỹ thuật in vivo cho phép nhân nhanh một đoạn gen mong muốn lên hàng triệu lần trong một khoảng thời gian ngắn. Phản ứng PCR hồn tồn dựa theo q trình sao chép ADN trong tế bào, trong đó ADN đƣợc nhân lên theo cơ chế bán bảo tồn. PCR đã đƣợc chứng minh là một trong những công cụ hữu hiệu trong chẩn đoán nhanh các bệnh truyền nhiễm [68,102]. Kỹ thuật này hiện nay đang đƣợc áp dùng trong nhiều lĩnh vực nhƣ khoa học hình sự, mơ bệnh học, các chẩn đốn trƣớc sinh và chẩn đoán về các mầm bệnh [24].
PCR đã đƣợc sử dụng để chuẩn đoán, xác định nhanh Shigella, Salmonella và
E. coli. Hai đoạn gen invA1 và invA2 đã đƣợc sử dụng làm trình tự thiết kế một cặp
39
Gen mã hóa cho độc tố của Shigella và E. coli (VirF) có độ dài khoảng 443 bp và 331 bp hay gen ipaH, ial cũng đƣợc sử dụng để phát hiện ra Shigella ở nồng độ 101 tế bào trong dịch nuôi cấy bằng phƣơng pháp này [64,97]. Phƣơng pháp PCR có độ nhạy gấp 102 tới 105 lần so với xét nghiệm hóa sinh tiêu chuẩn và xét nghiệm lai tách dòng. Bằng việc sử dụng các fluorophores và fluorophore kết hợp nhƣ một chất đánh dấu đặc hiệu loài, Qiuying Huang đã dùng phƣơng pháp real-time PCR để phát hiện đƣợc 8 nhóm vi khuẩn gây bệnh qua đƣờng thực phẩm trong cùng một phản ứng [85]. Vũ Đình Thiêm đã sử dụng phƣơng pháp real-time TaqMan PCR (real-time PCR), một phiên bản sửa đổi của ipaH-specific PCR để phát hiện Shigella khi theo dõi những bệnh nhân đi
khám do tiêu chảy tại Nha Trang, Khánh Hịa, Việt Nam [104]. Đích của cặp mồi là trình tự gen kháng nguyên xâm nhập H (ipaH) có ở cả bốn lồi vi khuẩn Shigella và Ecoli xâm nhập ruột. IpaH đã đƣợc phát hiện trong 55/ 60 (93%) mẫu cấy dƣơng tính Shigella, trong khi chỉ đƣợc phát hiện ở 87/ 245 (36%) bệnh nhân cấy âm tính Shigella
khơng bị bệnh lỵ (P <0,001). Độ nhạy của phƣơng pháp đƣợc tăng lên đối với trẻ em và những bệnh nhân bị bệnh lỵ và đạt 100% đối với trẻ em bị bệnh lỵ.
Kỹ thuật trở kháng và tính dẫn điện
Nguyên tắc của phƣơng pháp này dựa trên đặc tính của vi sinh vật là khi phát triển trong môi trƣờng nuôi cấy đã làm thay đổi đặc tính dẫn điện của mơi trƣờng. Bản thân các chất dinh dƣỡng trong môi trƣờng nhƣ đƣờng, polysaccharide, protein và lipid khơng hoặc chỉ tích điện rất ít nhƣng khi bị chuyển hóa thành các sản phẩm cuối cùng sẽ lại tích điện. Thí dụ glucose khơng tích điện nhƣng khi chuyển thành 2 phân tử axit lactic sẽ tích điện và khi vi sinh vật phát triển trong môi trƣờng nuôi cấy sẽ làm tăng độ dẫn điện và dung lƣợng điện (conductance capacitance) đồng thời làm giảm sự trở kháng điện và sự thay đổi tính dẫn điện. Trở kháng trên sẽ đƣợc đo và ghi lại bằng cặp điện cực qua đó đánh giá đƣợc cƣờng độ dịng điện thay đổi trong mơi trƣờng.
40
Hiện nay đã có rất nhiều kỹ thuật phân tích kiểm tra vi sinh vật trong thực phẩm với thời gian ngắn và độ tin cậy cao, có khá nhiều ƣu điểm hơn phƣơng pháp qui ƣớc thƣờng quy đã đƣợc sử dụng trong phịng thí nghiệm. Nhƣng trên thực tế, nhiều kĩ thuật chƣa đƣợc phổ biến tại các phịng thí nghiệm kiểm tra và cả các viện nghiên cứu do điều kiện trang thiết bị và thiếu cán bộ kĩ thuật chuyên sâu [15]. Đặc biệt đối với các phịng phân tích nhỏ, việc áp dụng những phƣơng pháp kĩ thuật mới hiện đại là một điều khó khả thi do thiếu kinh phí hoạt động và cán bộ chuyên trách. Các phịng phân tích nhỏ nhƣ trạm y tế gần nhƣ khơng có đầy đủ các dụng cụ lấy mẫu và không tự làm đƣợc các xét nghiệm nhanh để tham gia vào công tác điều tra ngộ độc thực phẩm [15]. Vì vậy hƣớng nghiên cứu để có thể đƣa ra các phƣơng pháp phân tích đủ độ tin cậy nhƣng đơn giản, rẻ tiền và dễ thực hiện đang đƣợc ƣu tiên.