Nguyên tắc: Phƣơng pháp sắc ký trao đổi ion dựa vào sự khác biệt về ion (các
chất cần tách ở dạng tƣơng tác tĩnh điện thuận nghịch với pha cố định có tích điện. Phƣơng pháp này bao gồm 2 pha: pha cố định (là một loại gel có mang nhóm chức tích điện, cụ thể ở đây là carboxymethyl sephadex, DE - 52 Cellulose) và pha động. Sắc ký
70
ion bao gồm 2 bƣớc: gắn protein vào các nhóm chứa điện tích cố định trên cột và chiết rút các protein gắn trên cột ra.
Phƣơng pháp sắc ký trao đổi ion trên cột CM - Sephadex
Rửa và làm trương nhựa: Nhựa đƣợc trộn với 10% thể tích đệm, để lắng dịch,
gạn bỏ các hạt lơ lửng. Khuấy nhẹ nhựa trƣơng với HCl 0,1 M (với 5 lần thể tích) duy trì trong 30 phút ở nhiệt độ phịng, sau đó rửa bằng nƣớc cất cho đến khi đạt đƣợc pH gần trung tính . Tiếp tục xử lý bằng đệm NaOH 0,1 M (với 5 lần thể tích) ngâm trong 30 phút ở nhiệt độ phịng và sau đó rửa lại bằng nƣớc cất cho đến khi pH đạt gần trung tính.
Nhồi cột gel: Cột đƣợc rửa và tráng sạch, lắp dây dẫn vào đầu ra, dựng cột lên
giá, chỉnh cho thắng đứng. Cho khoảng 1/3 thể tích đệm rồi cho bơng thủy tinh vào chặn dƣới đáy cột. Đóng khóa phía dƣới cột. Gel đƣợc khuấy nhẹ đều gel rồi từ từ đổ vào cột (tránh tạo bọt). Gel đƣợc cân bằng trong đệm cần chạy rồi để lắng tự nhiên. Mở khóa phía dƣới cho chảy bớt đệm đến sát lớp gel (tốc độ 10 ml/h). Sau đó cho cẩn thận tồn bộ lƣợng mẫu lectin cần tách vào cột. Để dung dịch này ngấm xuống hết. Thu dịch qua cột, có thể đổ trở lại cột cho chạy lại từ 1-3 lần cho các protein cần gắn gắn hết trên cột. Phần lectin không gắn trên cột đƣợc rửa ra bằng đệm NaCl 0,9% pH 6 với tốc độ tối đa 25 ml/h. Phần lectin gắn trên cột đƣợc đẩy ra bằng gradient nồng độ muối từ 0 – 1 M trong đệm với tốc độ chảy 20ml/h, tiến hành thu mỗi phân đoạn từ 1ml đến 3 ml.
Phƣơng pháp sắc ký trao đổi ion qua cột DE – 52 Cellulose
Rửa và làm trương nhựa: Nhựa đƣợc trộn với 10% thể tích đệm, để lắng dịch,
gạn bỏ các hạt lơ lửng. Khuấy nhẹ nhựa trƣơng với HCl 0,1M (với 5 lần thể tích) duy trì trong 30 phút ở nhiệt độ phịng, sau đó rửa bằng nƣớc cất cho đến khi đạt đƣợc pH 4. Tiếp tục xử lý bằng đệm NaOH 0,1 M (với 5 lần thể tích) ngâm trong 30 phút ở nhiệt độ phịng và sau đó rửa lại bằng nƣớc cất cho đến khi pH đạt hơn 8.
71
Nhồi cột gel: Nhựa trao đổi sau khi xử lí đƣợc nhồi lên cột có kích thƣớc 1x10
cm, cân bằng cột bằng đệm PB 0,02M pH 7,4. Sau đó cho cẩn thận tồn bộ lƣợng mẫu lectin cần tách vào cột. Để dung dịch này ngấm xuống hết. Thu dịch qua cột, có thể đổ trở lại cột cho chạy lại từ 1-3 lần cho các protein cần gắn gắn hết trên cột. Phần lectin không gắn trên cột đƣợc rửa ra bằng đệm PB 0,02M pH 7,4 với tốc độ tối đa 15 ml/h. Phần lectin gắn trên cột đƣợc đẩy ra bằng gradient nồng độ NaCl từ 0 – 1 M trong đệm glycin 0,05 M, pH 2,6 với tốc độ chảy 15ml/h, tiến hành thu mỗi phân đoạn từ 1ml đến 3 ml.