KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.3.1.3. Escherichia col
Các mẫu thức ăn đƣợc nghiền đồng thể hòa sau đó nuôi cấy trên môi trƣờng Endo ở 370
C trong 24- 48 giờ. Thu nhận các khuẩn lạc nghi ngờ với những đặc điểm tròn, nhỏ, có ánh kim, và làm chuyển màu môi trƣờng từ màu hồng sang đỏ sậm. Dƣới kính hiển vi quang học, tế bào có dạng hình que ngắn, bắt màu Gram âm (màu hồng) (hình 3.4).
Hình 3.4. Hình thái khuẩn lạc và tế bào E.coli
( trên môi trường Endo khuẩn lạc có màu vàng ánh kim, quan sát dưới kính hiển vi tế bào có dạng hình que ngắn, đơn, bắt màu Gram âm, đối chứng là vi khuẩn Bacillus Gram dương bắt
màu xanh tím- ảnh chụp bằng kính hiển vi quang học độ phóng đại 15x100)
Dựa vào các đặc điểm ban đầu về phân lập E. coli nhƣ đặc điểm khuẩn lạc trên môi trƣờng Endo, hình dạng tế bào, các phản ứng sinh hóa đặc trƣng (lên men glucose,
82
lên men lactose, không lên men manitol, sinh hơi, sinh indol, không sử dụng citrate trong môi trƣờng citrate simon, phản ứng đỏ metyl dƣơng tính…) cho thấy trong tổng số 212 mẫu thực phẩm đã có 110 mẫu bƣớc đầu phân lập đƣợc E. coli với số lƣợng là 107 chủng. Kết quả đƣợc trình bày trên Bảng 3.5.
Bảng 3.5. Kết quả phản ứng sinh hóa của các chủng E. coli phân lập
STT Đặc điểm Số lƣợng Tỷ lệ (%)
1 Giống với vi khuẩn E.coli (*) 107 50,47
2 Chƣa xác định đƣợc 105 49,53
3 Tổng số 212 100
Chú thích *:Thử nghiệm trên môi trường có tripton: có khả năng sinh indol Thử nghiệm MRVP: phản ứng MR dương tính, VP âm tính
Thử nghiệm trên môi trường manitol: lên men manitol, di động và sinh hơi Thử nghiệm simmons citrate: không sử dụng citrate làm nguồn cacbon Thử nghiệm trên môi trường Klinger: lên men glucose, lên men lactose,
không sinh H2S, có sinh hơi.
Kết quả phản ứng sinh hóa của chủng E. coli phân lập đƣợc minh họa trên hình 3.5.
Chú thích
ĐC1 -5: các thí nghiệm đối chứng ống 1: phản ứng MR dương tính ống 2: sinh indol trên môi trường có tripton
ống 3: Lên men manitol, di động, sinh hơi
ống 4: Không sử dụng citrate trên môi trường citrate simon
ống 5. Lên men lactose, glucose, sinh hơi, không sinh H2S
H×nh 3.5. KÕt qu¶ ph¶n øng sinh hãa cña E. coli
83
Bảng 3.5 cho thấy chỉ có 107 chủng trong tổng số 212 chủng phân lập có đặc điểm về khuẩn lạc, tế bào và tính chất sinh hóa phù hợp với E. coli. Tuy vậy, nếu chỉ dựa vào các đặc điểm này không đủ để khẳng định chính xác các chủng này là E. coli
(mặc dù môi trƣờng sử dụng trong nghiên cứu này là môi trƣờng phân biệt dùng để phân lập E. coli). Do vậy sau các bƣớc xác định tính chất sinh hóa, phản ứng ngƣng kết với kháng huyết thanh của E. coli ở các chủng phân lập phải đƣợc thực hiện là cần thiết. Hơn nữa, E. coli có rất nhiều các typ huyết thanh khác nhau và chỉ ít trong số đó mới là các chủng gây bệnh.
Nhằm xác định chủng gây bệnh, 107 chủng có tính chất sinh hóa giống với vi khuẩn E.coli đã đƣợc xác định theo phƣơng pháp thử hóa sinh đƣợc tiến hành ngƣng kết với kháng nguyên huyết thanh đặc hiệu của E.coli .
Kết quả đƣợc trình bày tại Bảng 3.6.
Bảng 3.6. Kết quả ngƣng kết với kháng huyết thanh của các chủng nghiên cứu
STT Kháng huyết thanh Dƣơng tính Tỷ lệ (%)
1 EPEC 47 43,92
2 O126 12 11,21
3 Tam giá II (Trivalent II) gồm: O86 : B7 + O119 : B1++++ O127 : B8
14 13,08
4 Tam giá III (Trivalent III) gồm: O125 : B15 + O126 : B16+ O128 : B12
16 14,95
Bảng 3.6 cho thấy đa số các chủng E.coli phân lập đƣợc trên thực phẩm thuộc về nhóm EPEC. Đây là nhóm thƣờng gây bệnh phổ biến tại các nƣớc nhiệt đới. Tuy chủng vi khuẩn này không gây ra những vụ dịch nghiêm trọng dẫn đến tử vong cho ngƣời nhiễm bệnh nhƣng cũng để lại nhiều hậu quả xấu ảnh hƣởng đến chất lƣợng thực phẩm và đời sống ngƣời dân. So sánh với các nghiên cứu gần đây về sự ô nhiễm của
84
E.coli trên thực phẩm cho thấy tỷ lệ phân lập đƣợc các chủng vi khuẩn này là 21,7%, trong nghiên cứu này tỷ lệ phân lập đƣợc E.coli là 41,98% trong đó EPEC là 3,3 %. Các mẫu phân lập đƣợc E.coli thƣờng tập trung vào là thịt, rau tƣơi (tƣơng tự với các nghiên cứu của Nguyễn Thị Thu Hà [4], Lê Hữu Nghị [12]). Tuy nhiên số lƣợng CFU vi khuẩn E.coli /g mẫu của chúng tôi là 2,1 x 104 cao hơn nhiều so với nghiên cứu trƣớc (khoảng 100 CFU/g mẫu [4]).
3.3.1.4. Staphylococcusaureus
Tiến hành nuôi cấy mẫu thực phẩm trên môi trƣờng Chapman ở 370
C trong vòng 24 – 48 h để phân lập vi khuẩn. Sau đó thu nhận các khuẩn lạc nghi ngờ có đặc điểm: tròn, lồi, bóng, đục, bờ rõ rệt, màu vàng, kích thƣớc trung bình từ 0,5 – 3 mm, làm chuyển màu môi trƣờng từ đỏ cam sang vàng sau 24 h nuôi cấy (Hình 3.6).
Hình 3.6. Hình ảnh khuẩn lạc S. aureus trên môi trƣờng Chapman
Chú thích: Khuẩn lạc nghi ngờ là S. aureus có màu vàng, tròn, bóng kích thước khoảng 0,5 – 3 mm, làm chuyển màu môi trường từ đỏ cam sang vàng
Kết quả phân lập vi khuẩn Staphylococcus trên các nhóm thực phẩm cho thấy dựa vào đặc điểm khuẩn lạc trên môi trƣờng phân biệt đã thu đƣợc 59 chủng có tính chất giống với S. aureus (tròn, lồi, bóng, đục, bờ rõ rệt, màu vàng, kích thƣớc trung
KL nghi nghi ngờ
85
bình từ 0,5 – 3 mm, làm chuyển màu môi trƣờng từ đỏ cam sang vàng sau 24 h nuôi cấy).
Để khẳng định các chủng đã đƣợc lựa chọn này đúng là vi khuẩn S. aureus, tiến hành nhuộm Gram và thực hiện thí nghiệm về các tính chất sinh hóa đặc trƣng với vi khuẩn S. aureus của 59 chủng đƣợc thu nhận. Kết quả nhuộm Gram của các chủng này đƣợc trình bày trên Bảng 3.7.
Bảng 3.7. Kết quả phân lập Staphylococcus trên các mẫu thức ăn
Số lƣợng mẫu Số lƣợng vi khuẩn phân lập
(*)
Kết quả nhuộm
Gram (**) Tỷ lệ (%)
112 59 34 30,36
Chú thích :
(*): Thu nhận vi khuẩn dựa vào đặc điểm khuẩn lạc
( ** ): Là các vi khuẩn mang đặc điểm của Staphylococcus( tế bào hình cầu, nhỏ, bắt màu Gram dương, có dạng đơn lẻ hoặc tụ lại như hình chùm nho).
Kết quả ở Bảng 3.7 cho thấy trên tổng số 59 chủng nghi ngờ bƣớc đầu thu đƣợc 34 chủng có đặc điểm tế bào điển hình giống với Staphylococcus (tế bào hình cầu, nhỏ, bắt màu Gram dƣơng, có dạng đơn lẻ hoặc tụ lại nhƣ hình chùm nho) (Hình 3.7).
Hình 3.7. Hình ảnh tế bào của chủng S. aureus phân lập
(Tế bào bắt màu Gram dương, hình cầu, chụp bằng kính hiển vi quang học độ phóng đại 15x100)
86
Dựa trên kết quả này, tiếp tục tiến hành quy trình xác định S. aureus bao gồm:
đặc điểm sinh trƣởng trên môi trƣờng Baird – Parker, phản ứng ngƣng kết với huyết tƣơng thỏ của các chủng thu nhận đƣợc.
Trƣớc tiên, các chủng này đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng Baird-Parker có bổ sung lòng đỏ trứng gà và Potassium tellurit (K2Cr2O3 2%) ở 370C/ 24-48 h. Thu nhận những khuẩn lạc mang đặc điểm: xung quanh có vòng trong suốt, trung tâm đen, tròn lồi, bờ đều, bóng (Hình 3.8). Kết quả đã thu nhận đƣợc 12 chủng có những đặc điểm này.
Hình 3.8. Hình ảnh khuẩn lạc của 6 chủng phân lập trên môi trƣờng Baird-Parker
Chú thích: các chủng Sa32, Sa18, Sa93, Sa4 mang đặc điểm của S. aureus ( xung quanh khuẩn lạc có vòng trong suốt, trung tâm đen).
Xác định S. aureus bằng phản ứng làm đông huyết tƣơng thỏ (coagulase test)
Coagulase là một enzym đƣợc sinh ra bởi một số vi sinh vật. Enzym này xúc tác cho phản ứng chuyển hóa fibrinogen thành fibrin, gây ra hiện tƣợng đông huyết tƣơng. Kỹ thuật xác định enzym này đƣợc dùng để phân biệt S. aureus với các nhóm
Staphylococus khác. Tiến hành thử nghiệm xác định hoạt tính coagulase bằng phản ứng đông huyết tƣơng thỏ đối với 34 chủng trực tiếp trên lam kính và trong ống nghiệm. Kết quả thu đƣợc thể hiện trên Bảng 3.8.
Sa5 Sa 14 Sa32 Sa 93 Sa 4 Sa18
87
Bảng 3.8. Kết quả xác định hoạt tính coagulase của các chủng phân lập
Tổng số vi khuẩn
Số lƣợng vi khuẩn có hoạt tính
coagulase tự do (*) coagulase liên kết (**)
34 19 19
Chú thích : * Thử nghiệm trong ống nghiệm tìm enzym coagulase tự do: trong ống nghiệm huyết tương đông cứng, khó di động (phụ lục trang 17, 18)
** : Thử nghiệm trên lam kính tìm enzym coagulase liên kết, kết quả dương tính khi trên lam kính tụ cầu tụ lại với nhau (phụ lục trang 17, 18)
Kết quả trên Bảng 3.8 cho thấy đã có 19 chủng đều có hoạt tính coagulase tự do và liên kết. Tuy vậy trong số 19 chủng này, có 6 chủng có hoạt tính coagulase liên kết 4+ (Huyết tƣơng đông cứng sau 4-6h, khó di động) và đƣợc khẳng định sơ bộ là S. aureus chiếm 17,6% trong các nhóm của tụ cầu khuẩn, còn lại là các chủng có hoạt tính coagulase liên kết từ 1 – 3+ (Huyết tƣơng đông không chắc sau 6h, dễ di động, không đông sau 24h hoặc đông thành cục nhỏ, không liên kết thành khối) Trong số này, nhóm tụ cầu khuẩn có enzym coagulase S. intermedius chiếm 47,1%. Còn lại là các nhóm tụ cầu khuẩn khác chiếm 35,3%.
Kết hợp các kết quả thu đƣợc từ các thí nghiệm (bao gồm quan sát đặc điểm khuẩn lạc trên môi trƣờng Chapman, môi trƣờng Baird – Parker, hình dạng và cách sắp xếp tế bào, kết quả thử nghiệm coagulase) cho thấy từ 112 mẫu thực phẩm đã thu nhận đƣợc 4 chủng tụ cầu khuẩn gây bệnh S. aureus. Các nghiên cứu gần đây cũng cho thấy vi khuẩn này là một trong những nguyên nhân chính gây ngộ độc thực phẩm tập thể [30,108]. 3 chủng tụ cầu vàng phân lập đƣợc trong nghiên cứu này có nguồn gốc từ nhóm thực phẩm sống ăn trực tiếp (rau ăn sống, dƣa muối). Các chủng này sẽ đƣợc giữ lại để sử dụng trong nghiên cứu mối tƣơng tác với lectin.
Nhƣ vậy từ khoảng hơn 100 mẫu thực phẩm thu thập tại các chợ khác nhau trên địa bàn Hà Nội và Hà Tây cũ, chúng tôi đã thu nhận đƣợc một số chủng vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm điển hình: Salmonella (5 chủng), Shigella flexneri (4 chủng), E.
88
coli gây bệnh (47 chủng) và Staphylococcus aureus (4 chủng). Thời gian để phát hiện đƣợc các chủng vi khuẩn này trong thực phẩm theo phƣơng pháp thƣờng quy thƣờng kéo dài từ 3- 7 ngày. Sự phát hiện chậm các vi khuẩn gây bệnh trong mẫu thực phẩm là một trong những nguyên nhân góp phần giúp cho những tác nhân gây bệnh này có cơ hội lây lan trong cộng đồng, ảnh hƣởng đến sức khỏe của nhiều ngƣời. Hơn thế nữa, kết quả xác định vi khuẩn có thể bị ảnh hƣởng bởi các chất kháng sinh tồn dƣ trong thực phẩm, lƣợng mẫu thu thập không đủ lớn và số lƣợng vi khuẩn trong mẫu nhỏ. Với mục tiêu tìm kiếm thêm các phƣơng pháp mới có khả năng phát hiện nhanh các vi khuẩn này, nghiên cứu đƣợc tiếp tục với hƣớng là sử dụng lectin chiết xuất từ thực vật để gây ngƣng kết các vi khuẩn đã phân lập này, bƣớc đầu tìm ra phƣơng pháp phát hiện vi khuẩn bằng lectin.