KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.3.2.5. Nghiên cứu tính chất gây ngƣng kết đặc hiệu của các mẫu lectin
Để lectin trở thành một công cụ mới trong chẩn đoán, phân loại vi khuẩn, tính đặc hiệu của lectin là một trong những đặc điểm quan trọng cần đƣợc nghiên cứu. Việc ngƣng kết chéo giữa lectin với các vi khuẩn khác nhau sẽ làm giảm tính đặc hiệu của nó. Vì vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu sự ngƣng kết chéo của lectin với các đối tƣợng vi khuẩn nghiên cứu. Kết quả đƣợc trình bày tại Bảng 3.13.
102
Bảng 3.13. Sự tƣơng tác giữa lectin thực vật với các vi khuẩn nghiên cứu
Lectin Samonella S. flexneri EPEC S. aureus
Sal1 Sal2 Sal3 Sal4 Sal5 Sf1 Sf2 Sf3 Sf4 E1 E2 E3 E4 Sa 1 Sa2 Sa3 Sa4 Sa5
Náng hoa đỏ - - - + ++ ++ + + + + + - - - - - Náng hoa trắng - - - + ++ ++ + - - - - Đậu ma - - - ± ± - - ++ ++ ++ ++ - - - - - Phong huệ ++ ++ ++ + + - - - ++ ++ ++ ++ ++ Hành tây - - - + + ++ ++ - - - - - Tỏi ta - - - + - + + + + + + ++ - + + - Tỏi tây + + ++ ++ ++ + ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ Hẹ - - - + + + Hành hƣơng +++ +++ +++ +++ ++ + + + ++ ++ ++ ++ + ++ ++ ++ ++ ++ Nén + ++ ++ - - + + + + - - - - Lẻ bạn - - - + + ++ ++ - - + + + + + + + Riềng tinh ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ +++ +++ +++ ++ + +++ Thảo quả - - - + + ++ + - - - + + + - Địa liền - - - ++ ++ ++ + + + + - + ++ ++ ++ ++ Gừng đỏ - - - +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ - - - - - Lƣỡi hổ điệp đỏ - - - + + + + - - + ++ - - - - -
Lan tai voi + ++ ++ ++ ++ - - - -
Bạch trúc - - - ++ ++ ++ + + ++ ++ ++ - - - - -
103 Lúa - - - ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ - + + + + Tre ngà - - - - Cọ - - - - Khoai lệ phố - - - + + ++ ++ + ++ ++ ++ ++ + + - - Khoai nƣớc - - - ++ ++ + + - Khoai sọ - - - - Môn đốm - - - + + - + Dọc mùng - - - +++ +++ +++ +++ ++ ++ ++ +++ +++ Củ chóc - - - + ++ ++ + - + + ++ + ++ ++ ++ + Bản hạ sẻ + + - - - ++ ++ ++ + + + ++ ++ + + + Bản hạn roi + + ++ ++ ++ - - - - Mùng thơm - - - +++ +++ +++ + +++ ++ + ++ + + + - - Ráy leo xẻ lá - - - - Tú cầu đỏ + ++ + ++ + - - - - Riềng nếp + + + + + ++ ++ ++ ++ ++ + ++ ++ - - - - - Phong huệ vàng - - - ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ - - - - - Hành ta + ++ ++ ++ ++ - - - - Riềng tía ++ ++ ++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ - - - - - Gừng gió - - - ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ - - - - - Mộc lan ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ - - - - -
Chú thích Sal1-4: Salmonella phân lập, Sal 5: Salmonella ATCC 13076 Sf 1-3: Shigella flexneri phân lập, Sf 4: Shigella ATCC 9199
EPEC: E1-3 Enteropathogenic Escherichia coli phân lập, E4 E.coli ATCC 25922
104
Kết quả thu đƣợc cho thấy có 3 mẫu lectin từ Tỏi tây, Hành hƣơng, Riềng tinh có khả năng gây ngƣng kết với cả 4 nhóm vi khuẩn nghiên cứu (chiếm tỷ lệ 7,7%), còn lectin Tre ngà, Cọ, Môn đốm và Khoai sọ thì không gây ngƣng kết với bất kì vi khuẩn nào (chiếm tỷ lệ 10,3%). Lectin Thuỷ tiên, Lan cau tím, Tre gai, Gừng, Lan hồ điệp trắng, Lan vẩy rắn, Môn to, Cọ xẻ, Ngô, Môn trƣờng sinh xanh, Lan thuỷ tiên vàng không có khả năng gây ngƣng kết các loài vi khuẩn thuộc các chi khác chi Staphylococcus. Lectin Đậu ma chỉ gây ngƣng kết với một mình vi khuẩn E. coli. Lectin Tú cầu đỏ cũng ngƣng kết với riêng Salmonella trong số 4 nhóm vi khuẩn nghiên cứu .
Từ các kết quả thu đƣợc, chúng tôi tiến hành xây dựng cây phân loại 4 nhóm vi khuẩn nghiên cứu dựa vào sự khác biệt trong phản ứng ngƣng kết với các lectin đặc hiệu.
Kết quả đƣợc trình bày tại Hình 3.13.
Hình 3.13. Sơ đồ phân biệt 4 loại vi khuẩn nghiên cứu bằng lectin
Chú thích: Sal: Salmonella Ec: Escherichia coli, Sf: Shigella flexneri
Sta: Staphylococcus aureus
(+) : Có phản ứng gây ngưng kết vi khuẩn. (-) : Không có phản ứng gây ngưng kết vi khuẩn
(+)(-) (-) (+) (-) (+) Riềng nếp Sa Tú cầu đỏ St, Ec Ec Sal Sf, Sa Sf (-) Sal, Ec, Sf, Sa Gừng gió
105
Hình 3.13 cho thấy khi sử dụng lectin Gừng gió đã chia 4 vi khuẩn này thành 2 nhóm: nhóm ngƣng kết (+) với lectin này gồm Salmonella , Escherichia coli, và nhóm không ngƣng kết (-) với lectin Gừng gió gồm S. flexneri, S. aureus.
Tiếp tục, sử dụng lectin Tú cầu đỏ để phân biệt Salmonella với E. coli, (trong đó Salmonella có phản ứng dƣơng tính với lectin Tú cầu đỏ còn E. colithì không có đặc điểm này).
Tƣơng tự, dùng lectin Riềng nếp để phân biệt S. flexneri và S. aureus (trong nhóm vi khuẩn không ngƣng kết với Gừng gió) bằng phản ứng ngƣng kết. Kết quả cho thấy S. flexneri có phản ứng ngƣng kết còn S. aureus không có phản ứng ngƣng kết xảy ra.
Bảng 3.13 cũng cho thấy lectin Đậu ma liên kết tốt với vi khuẩn EPEC mà không liên kết với các nhóm vi khuẩn khác và lectin Tú cầu đỏ cũng liên kết với chỉ riêng vi khuẩn Salmonella. Đây là một kết quả rất có ý nghĩa vì đã cho thấy có những lectin đặc hiệu với một loài vi khuẩn. Do vậy hƣớng nghiên cứu sử dụng lectin trong phân loại vi khuẩn sẽ có ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao.
Mối liên quan giữa tính đặc hiệu đƣờng và tính chất gây ngƣng kết vi khuẩn của lectin
Trong số các nhóm lectin này, đáng lƣu ý là lectin Đậu ma gây ngƣng kết đặc hiệu với E. coli và lectin Tú cầu đỏ gây ngƣng kết đặc hiệu với Salmonella.
Kết quả về tính đặc hiệu đƣờng của lectin Đậu ma cho thấy: Lectin Đậu ma đặc hiệu mạnh nhất với đƣờng galactose ở nồng độ đƣờng rất thấp (6,25 mM), đồng thời cũng bị ngƣng kết bởi đƣờng glucose (Glu); glucosamine (GlcN); N-Acetyl- glucosamine (GlcNAc) và fucose (Fuc) (Bảng 3.13).
Hơn thế nữa những công bố về thành phần oligosacharide bề mặt tế bào vi khuẩn E.coli (nhóm vi khuẩn liên kết đặc hiệu với lectin này) – tại vị trí kháng nguyên O bao gồm D-galactose, L-fucose, and 2-acetamido-2-deoxy-D-galactose theo tỷ lệ 2:1:2. Đồng thời thành phần polysaccharide trong chuỗi tetrasaccharide bao gồm D-galactose và 2-acetamido-2-deoxy-D-galactose, với L-fucose đóng vai
106
trò là các đơn vị lặp lại trong chuỗi bên pentasaccharide [98]. Điều này có thể giải thích tính chất đặc hiệu trong ngƣng kết của lectin Đậu ma với vi khuẩn E. coli.
Về thành phần oligosaccharide trên bề mặt tế bào Salmonella, Bin Liu đã xác định thành phần đƣờng của chuỗi bên O của Salmonella O66 bao gồm glucose và galactose theo tỷ lệ 1:2,2 cũng cùng tỷ lệ với N-Acetyl- glucosamine (GlcNAc) [38], tƣơng tự với kết quả của Dmitriev cho rằng thành phần chính của O – polysaccharide ở Salmonella O55 là Glc, GlcN và GalN [44]. Các công bố về thành phần chính trong cấu trúc kháng nguyên của Salmonella O6, 7 còn có thêm thành phần là đƣờng mannose [99].
Đối chiếu với lectin Tú cầu đỏ cho thấy lectin này bị ức chế bởi đƣờng D – GalN và mannose một thành phần đƣờng chủ yếu trong cấu trúc kháng nguyên bề mặt của Salmonella. Do vậy có thể kết luận đƣợc tính gây ngƣng kết của lectin chịu ảnh hƣởng chính bởi các gốc đƣờng trên bề mặt tế bào vi khuẩn.
Nhƣ vậy, các kết quả nghiên cứu đầu tiên về khả năng gây ngƣng kết của một số lectin từ thực vật thu thập tại Việt Nam đã cho những kết quả khả quan. Tập hợp của 3 lectin từ Địa liền, Thủy tiên và Phong huệ đã có thể phân biệt đƣợc 4 loại vi khuẩn nghiên cứu là Salmonella, Shigella, E.coli thuộc nhóm EPEC và
Staphylococus aureus. Đặc biệt lectin từ Đậu ma liên kết đặc hiệu với vi khuẩn E. coli gây bệnh và lectin Tú cầu đỏ đặc hiệu với Salmonella. Việc phối hợp các lectin này với nhau sẽ có thể tạo thành một thử nghiệm tốt trong phát hiện, phân loại vi khuẩn.
Tuy vậy, các mẫu lectin sử dụng trong các thí nghiệm trên là ở dạng dịch chiết thô cơ bản do vậy có thể ảnh hƣởng đến độ ngƣng kết của các phản ứng với vi khuẩn. Nhằm nghiên cứu sâu hơn các tính chất của các lectin có ngƣng kết tốt với vi khuẩn là lectin từ Đậu ma và lectin từ Tú cầu đỏ, tiếp tục tiến hành nghiên cứu để tách chiết thu hồi lectin tinh sạch đồng thời so sánh độ nhạy của phản ứng ngƣng kết vi khuẩn giữa dịch chiết lectin thô và dịch chiết lectin tinh sạch, cũng nhƣ nghiên cứu điều kiện phản ứng tối ƣu giữa lectin và vi khuẩn.
107
3.4. TINH CHẾ VÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH HÓA SINH MIỄN DỊCH CỦA 2 MẪU LECTIN CHỌN LỌC