Hoạt độ của lectin đƣợc xác định bằng khả năng ngƣng kết hồng cầu theo phƣơng pháp của Kort. A. A. Khả năng ngƣng kết hồng cầu (HAA) đƣợc tính bằng nghịch đảo của độ pha lỗng lớn nhất của dịch lectin cịn có khả năng gây ngƣng kết tồn bộ lƣợng hồng cầu (đối với mẫu hai lá mầm, sử dụng hồng cầu ngƣời với 3 nhóm máu A, B, O, đối với mẫu thực vật một lá mầm, sử dụng hồng cầu thỏ).
Chuẩn bị hồng cầu: Hồng cầu ngƣời các nhóm máu A, B, O đã tách riêng ra
khỏi huyết thanh. Mẫu hồng cầu trƣớc tiên đƣợc rửa sạch bằng nƣớc muối sinh lý 0,9% với tỷ lệ 1/20 (v/v), tiếp theo đem ly tâm mẫu ở 1200 vòng/ phút ở 4oC trong 10 phút, loại bỏ dịch nổi. Bƣớc này đƣợc lặp lại từ 1 -2 lần. Đối với hồng cầu thỏ, mẫu hồng cầu đƣợc chống đông bằng dung dịch natri citrate 3,8%. Mẫu hồng cầu thỏ tiếp tục đƣợc rửa sạch tƣơng tự nhƣ hồng cầu ngƣời, chỉ khác bƣớc rửa đƣợc lặp lại 3 lần. Các tế bào hồng cầu sau khi rửa xong đƣợc pha loãng về nồng độ 2% bằng nƣớc muối sinh lý 0,9%.
Phản ứng ngưng kết hồng cầu bằng lectin: Bổ sung vào mỗi giếng bản thử đáy
nhọn microtiter 50 μl đệm PBS. Dịch chiết lectin thô đƣợc pha loãng theo số mũ 2 bằng cách bổ sung 50 μl dịch chiết lectin vào giếng thứ nhất của bản thử, trộn đều rồi
66
hút sang giếng tiếp theo 50 μl dịch hỗn hợp. Làm tƣơng tự với các giếng tiếp theo, bỏ đi 50 μl giếng cuối cùng sau khi trộn.
Cho vào mỗi giếng 50 μl hồng cầu đã pha loãng, để bản nhựa ở 37o
C, sau 30 phút quan sát kết quả. Hoạt độ tổng số của lectin (đơn vị là HAA) đƣợc tính theo công thức:
HĐTS = V.2
n
50
V : Thể tích mẫu thí nghiệm tính bằng μl
Trong đó N : Độ pha lỗng cuối cùng cịn hoạt tính ngƣng kết hồng cầu 50 : Thể tích mẫu lectin đem thử hoạt tính (đơn vị µl)
2 : Độ pha loãng liên tiếp
Hoạt độ riêng (HĐR): là giá trị hoạt độ ngƣng kết hồng cầu của 1mg protein đƣợc tính theo cơng thức:
HĐTS HĐR =
[Pr]
Trong đó HĐTS: Hoạt độ tổng số, [Pr]: Hàm lượng protein tính bằng mg