Xác định hàm lượng protein tổng số bằng phương pháp Lowry (1951)
Nguyên tắc: Phƣơng pháp dựa trên cơ sở phản ứng khử Cu2+ thành Cu+ của protein tạo thành phức hợp protein – Cu. Phức hợp này tiếp tục kết hợp với thuốc thử Folin tạo phức màu xanh hấp thụ cực đại ở bƣớc sóng 675 nm [17]. Dựa vào đồ thị chuẩn của BSA (albumin huyết thanh bị) có thể tính đƣợc làm lƣợng protein trong mẫu nghiên cứu.
Lập đồ thị chuẩn protein: Chuẩn bị các dung dịch BSA chuẩn với các nồng độ
0,2; 0,4; 0,6; 0,8 và 1 mg/ml. Tiến hành làm phản ứng màu với dịch chuẩn theo thứ tự, thành phần nhờ tỉ lệ các hóa chất nhƣ với dịch nghiên cứu. Dựng độ thị biểu diễn mối tƣơng quan giữa mật độ quang học và nồng độ protein (Hình 2.1).
Tiến hành: Hút chính xác 0,2 ml dung dịch nghiên cứu vào ống nghiệm sạch,
khô, thêm 1 ml dung dịch gồm 49 ml Na2CO3 2% hòa tan trong NaOH 0,1 N và 1 ml dung dịch CuSO4.5H2O 0,5% pha trong dung dịch sodium citrate 1%, lắc đều và giữ ở nhiệt độ phịng 10 phút. Thêm chính xác 0,05 ml dung dịch Folin đã pha loãng 2 lần, lắc đều và đem so màu trên máy quang phổ bƣớc sóng 675 nm.
Từ kết quả về mật độ quang phổ của mẫu thí nghiệm, đối chiếu với đồ thị chuẩn để tính hàm lƣợng protein trong 1 ml dịch nghiên cứu và tính ra hàm lƣợng % protein trong nguyên liệu.
69
Hình 2.1. Đồ thị biểu diễn mối tƣơng quan giữa mật độ quang học và nồng độ protein chuẩn theo phƣơng pháp Lowry
Định lượng protein bằng đo quang phổ ở bước sóng 280nm
Nguyên tắc: Phƣơng pháp dựa trên cơ sở là các protein hấp thụ cực đại ở bƣớc
sóng 280nm do có mặt các axit amin thơm nhƣ tryptophan, tyrosine và phenylalanine. Trong quá trình thực hiện sắc ký để tinh chế lectin, hàm lƣợng protein đƣợc xác định theo phƣơng pháp đo phổ hấp thụ tử ngoại bằng máy quang phổ (bƣớc sóng λ = 280nm) với chất chuẩn là BSA (Bovine serum albumin – albumin huyết thanh bị) có hệ số tắt E280 = 0,67.
Khi đó hàm lƣợng protein đƣợc tính theo cơng thức: [protein] = 0D280nm x độ pha lỗng / 0,67(mg/ml)