KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.4.1.3. Tinh chế ĐM 2 trên cột sắc ký trao đổi ion CM-Sephade
Tiếp tục thực hiện quá trình tinh chế dịch chiết lectin đã đƣợc loại bỏ một phần các protein tạp bằng phƣơng pháp sắc ký trao đổi ion trên cột CM – Sephadex. Dịch ĐM 2 đƣợc đƣa lên cột CM – Sephadex. Thu dịch qua cột, lặp lại quá trình sắc kí từ 2-3 để đảm bảo quá trình hấp phụ tốt của các protein trong dịch. Dùng NaCl 0,9%, pH 6 để rửa phần lectin không gắn trên cột với tốc độ 25 ml/h. Phần lectin gắn trên cột đƣợc đẩy ra bằng gradient nồng độ muối từ 0 – 1 M trong đệm với tốc độ chảy 20 ml/h, tiến hành thu các phân đoạn.
Quá trình này đã giúp thu đƣợc 55 phân đoạn sau sắc ký, mỗi phân đoạn 2 ml. Các phân đoạn này sau đó đƣợc kiểm tra hoạt độ lectin bằng phản ứng ngƣng kết hồng cầu và xác định hàm lƣợng protein. Kết quả đƣợc thể hiện trên Hình 3.14.
110
Hình 3.14. Sắc ký đồ ĐM-2 trên cột CM-Sephadex
Chú thích: Kích thước cột 1,5 cm x 100 cm. Đệm gắn: dung dịch NaCl 0,9 % pH 6 Thể tích mỗi phân đoạn 2 ml, phản hấp phụ bằng gradient NaCl 0-1 M
Các kết quả trên Hình 3.14 cho thấy, dịch chiết ĐM-2 khi chạy qua cột CM- Sephadex cho 3 đỉnh protein (P1, P2, P3) với hàm lƣợng protein cao nhất (từ 0,86 – 1, 77 mg). Tuy vậy chỉ có đỉnh P2 (phân đoạn 30-33) là vừa có lƣợng protein tƣơng đối cao (1,77 mg) vừa có hoạt độ lectin mạnh (7680 HAA), còn đỉnh P1 và P3 thì hàm lƣợng protein cao nhƣng hoạt độ lectin lại thấp. Do vậy P2 chính là đỉnh lectin cần thu và đƣợc gọi là chế phẩm lectin Đậu ma 3 (ĐM-3). ĐM-3 đƣợc đẩy ra ở nồng độ muối từ 0,48 – 0,52 M với độ tinh sạch gấp 5,3 lần so với ĐM-2.
Kiểm tra độ tinh sạch của chế phẩm: Chế phẩm lectin của hạt Đậu ma sau
khi đƣợc tinh chế bằng sắc ký đã đƣợc kiểm tra độ tinh sạch bằng phƣơng pháp điện di biến tính trên gel polyacrylamide 12,5% (SDS – PAGE). Kết quả đƣợc thể hiện trên Hình 3.15. Hoạt độ lectin Hàm lƣợng protein P1 P2 (L1) P3
111
Hình 3.15. Ảnh điện di lectin hạt Đậu ma
Chú thích: DT: Dịch chiết thô CP1: Chế phẩm Đậu ma 1 CP2: Chế phẩm Đậu ma 2 Qc: Dịch qua cột L1: Đỉnh lectin (chế phẩm Đậu ma 3) P1: Đỉnh protein thứ nhất P1 P3: Đỉnh protein thứ ba (P3)
Trên điện di đồ có thể thấy ở giếng mẫu dịch chiết lectin hạt Đậu ma thô (DT) cho nhiều băng protein khác nhau với hàm lƣợng cao. Ở giếng là mẫu dịch chiết ĐM – 1 đã giảm chỉ còn khoảng 6 băng polypeptide (nguyên nhân là do dịch chiết này đã điều chỉnh pH xuống 3,5 và loại bỏ cặn tủa, do vậy hàm lƣợng protein tạp đã giảm đi nhiều). Giếng CP2 là mẫu lectin đã đƣợc điều chỉnh tăng pH lên 9,5 và loại bỏ tiếp cặn tủa, do vậy lƣợng protein của mẫu này tiếp tục giảm. Ba giếng L1, P1, P3 là các mẫu lectin sau khi đƣợc tinh chế qua cột sắc ký trao đổi ion CM- Sephadex G trong đó hai đỉnh protein P1 và P3 đều vẫn còn 2 băng polypeptide, trong khi đỉnh L1 (chính là ĐM – 3) chỉ còn lại 1 băng protein duy nhất với khối lƣợng phân tử khoảng 33 kDa. Trong các nghiên cứu về tinh chế lectin thực vật, lectin thu đƣợc thƣờng có khối lƣợng phân tử nhỏ (25 – 35 kDa) [56] do vậy đây có thể đúng là lectin ĐM – 3 mà chúng tôi cần.