Kỹ thuật phát hiện vi khuẩn dựa theo TCVN 4829: 2005; ISO 6579: 2002 [9, 25,49].
58
+ Tăng sinh sơ bộ trong môi trƣờng lỏng không chọn lọc: Chuẩn bị mẫu, đồng nhất mẫu: 25 g mẫu thực phẩm đƣợc cắt nhỏ cho vào bình chứa 225 ml BPW (buffered peptone water) 2%. Lắc đều trong 2 phút rồi để tủ ủ 37OC trong 16 – 20 giờ.
+ Tăng sinh trong môi trƣờng lỏng chọn lọc: Hút 1ml dung dịch BPW đã ủ ở trên cho vào một ống nghiệm chứa 10 ml canh thang môi trƣờng Rappaport Vassiliadis và Tetrathionat/novobioxin Muller Kauffmann để ở tủ ấm 37OC trong 24 giờ.
+ Đổ đĩa và nhận dạng: Cấy vi khuẩn từ ống tăng sinh lên 2 đĩa thạch SS và 2 đĩa thạch xanh Brilliant, nuôi cấy ở 37OC trong 48 giờ đối với thạch SS và 24 giờ đối với đĩa thạch xanh Brilliant (cần cấy thƣa để tạo khuẩn lạc riêng rẽ). Quan sát khuẩn lạc: Trên môi trƣờng thạch SS khuẩn lạc Salmonella trong, tròn, nhỏ, bóng, bờ đều (có thể có khuẩn lạc có chấm đen ở giữa do sinh H2S), trên môi trƣờng thạch xanh Brilliant khuẩn lạc có màu hồng. Khuẩn lạc Shigella trên môi trƣờng SS có đặc điểm khuẩn lạc có màu hơi vàng hoặc hồng, bờ tròn đều, trong, nhẵn, bóng.
+ Khẳng định và nhận dạng: bằng phép thử hóa sinh và huyết thanh thích hợp Cấy chuyển các khuẩn lạc nghi ngờ là Salmonella, Shigella vào 7 môi trƣờng chẩn đoán để xác định các tính chất sinh hoá (Môi trƣờng KIA (Kligler Irion Agar), môi trƣờng Mannit di động, môi trƣờng Ure Indol, môi trƣờng LDC ( Lysine Decacboxylase), môi trƣờng ODC (Orthintn Doecaboxylase), môi trƣờng ADH (Arginin Dehydrolase), môi trƣờng ONPG (o-nitro-phenyl-B-d-Galactopysanosed).
Nuôi cất ở 370C, đọc kết quả sau 24 h.
Thử nghiệm trên môi trường KIA
Thử nghiệm này dùng để kiểm tra khả năng sử dụng các nguồn carbon (glucose và lactose) đồng thời kiểm tra khả năng sinh H2S và sinh hơi của vi khuẩn.
- Vi khuẩn đƣợc cấy lên trên mặt thạch nghiêng của ống môi trƣờng KIA. Để ống thạch trong tủ ấm 370
59
- Quan sát ống thạch:
+ Môi trƣờng phía trên bị kiềm hóa, mặt thạch nghiêng có màu đỏ, môi trƣờng phía dƣới bị acid hoá có màu vàng: vi khuẩn sử dụng glucose không sử dụng lactose làm nguồn carbon .
+ Có các bọt khí ở bên trong hoặc làm vỡ thạch và đẩy thạch lên khỏi đáy ống: có sinh khí do vi khuẩn lên men glucose.
+ Xuất hiện kết tủa có màu đen: vi khuẩn sinh H2S
Vi khuẩn Salmonella: sử dụng glucose, không sử dụng lactose, sinh hơi, sinh H2S.
Vi khuẩn Shigella: sử dụng glucose, không sử dụng lactose, không sinh H2S.
Thử nghiệm khả năng lên men Mannitol
- Vi khuẩn đƣợc nuôi trong môi trƣờng Mannit ở 370C trong 24 h. - Môi trƣờng chuyển từ màu đỏ sang vàng: Vi khuẩn lên men mannitol - Thạch bị đẩy lên cao khỏi đáy ống: Vi khuẩn có sinh khí (hơi).
- Khả năng di động: vi khuẩn phát triển lan ra khỏi đƣờng cấy ban đầu. Vi khuẩn Salmonella: lên men mannitol, sinh hơi, di động
Vi khuẩn Shigella: lên men mannitol, không sinh hơi, không di động
Thử nghiệm urease
- Sinh khối vi khuẩn đƣợc cấy vào môi trƣờng lỏng Ure- Indol và để ở 370C trong 24 h.
- Môi trƣờng giữ nguyên màu ban đầu (màu vàng cam): vi khuẩn không có khả năng sinh urease.
- Môi trƣờng chuyển màu đỏ tím: vi khuẩn có sinh urease - Nhỏ 2-3 giọt thuốc thử Kovacs vào ống nghiệm nuôi cấy.
+ Nếu xuất hiện một vòng đỏ trên bề mặt dịch nuôi cấy: vi khuẩn có sinh Indol + Nếu xuất hiện vòng màu vàng (xanh vàng): vi khuẩn không sinh Indol
60
Vi khuẩn Shigella: Không sinh indol, không sinh urease
Thử nghiệm LDC
- Vi khuẩn đƣợc cấy ở mật độ thấp trong môi trƣờng lỏng chứa LDC, sau đó bổ sung 2-3 giọt parafin đã khử trùng nhằm tạo điều kiện kị khí, ủ ở 370C trong 24 h.
- Phản ứng (+) khi môi trƣờng trở nên đục và có màu tím; (-) khi môi trƣờng trong và có màu vàng.
Vi khuẩn Salmonella: phản ứng LDC dƣơng tính Vi khuẩn Shigella: phản ứng LDC âm tính
Phương pháp xác định khả năng sử dụng citrate làm nguồn cacbon
- Vi khuẩn đƣợc cấy lên trên môi trƣờng có citrate và bromothymolblue rồi đƣợc ủ trong tủ ấm 370C trong vòng 24 h.
o môi trƣờng chuyển từ màu xanh lá cây sang màu xanh dƣơng: vi khuẩn có sử dụng citrate
o môi trƣờng không chuyển màu giữ nguyên màu xanh lá cây: vi khuẩn không sử dụng citrate .
Vi khuẩn Salmonella, Shigella: Không sử dụng citrate nhƣ một nguồn carbon
Ngưng kết với kháng huyết thanh đặc hiệu
- Sinh khối của vi khuẩn đƣợc hòa vào vào giọt nƣớc muối đẳng trƣơng đƣợc đặt trên lam kính.
- Nhỏ một giọt kháng huyết thanh lên lam kính
- Lắc nhẹ lam kính để trộn đều vi khuẩn và huyết thanh
Hiện tƣợng ngƣng kết xảy ra nếu xuất hiện các hạt kết tủa trên lam. Hạt càng rõ khi càng lắc nhiều, dịch vi khuẩn trở nên trong hơn.