+ Lấy mẫu và đồng nhất mẫu : Cân chính xác 25 g (ml) thực phẩm cho vào
bình nón chứa 225 ml dung dịch BPW. Mẫu đƣợc thu nhận và nuôi cấy trên môi trƣờng Chapman ở 370
C trong 24 – 48 h. Lựa chọn các khuẩn lạc có đặc điểm: trịn, nhỏ, lồi, mặt nhẵn bóng, đục, bờ rõ rệt, màu vàng. Khuẩn lạc điển hình đƣợc cấy chuyển sang mơi trƣờng thạch nghiêng ủ ở nhiệt độ 370C, sau 24 h tiến hành nhuộm Gram, quan sát hình dạng tế bào trên kính hiển vi.
63
Nhuộm Gram quan sát trực tiếp vi khuẩn: S. aureus hình cầu, nhỏ, ở dạng
đơn lẻ hoặc tụ lại hình chùm nho, Gram dƣơng, bắt màu tím đậm.
Khả năng lên men đƣờng manitol
Sinh trƣởng trên môi trƣờng Chapman sau 24 h đến 48 h, tụ cầu gây bệnh sẽ làm chuyển màu mơi trƣờng từ đỏ sang vàng, tạo hơi có mùi chua.
Thử nghiệm trên môi trƣờng Baird-Parker
Tiến hành nuôi cấy vi khuẩn lên bề mặt đĩa thạch Baird-Parker chứa dung dịch lịng đỏ trứng đã đƣợc hong khơ. Láng đều sao cho dung dịch đƣợc cấy phân bố đều trên mặt thạch. Để tủ ấm 370C/24-48 h. Đọc kết quả.
Kết quả: Lấy đĩa thạch đã nuôi cấy qua đêm mang ra quan sát nếu thấy xuất hiện khuẩn lạc có vịng trong xung quanh, trung tâm đen, trịn lồi, bờ đều, bóng thì xác định là S. aureus.
Xác định enzym coagulase
Là enzym làm đông huyết tƣơng tự do và liên kết. Nếu có mặt Staphylocoagulase tự do cho phép xác định là tụ cầu khuẩn gây bệnh.
- Chuẩn bị huyết tƣơng thỏ theo tỉ lệ 1ml máu bổ sung thêm 0,35 ml sodiumnitrate 3,8%, li tâm, thu phần huyết tƣơng ở trên.
- Thử nghiệm trên lam kính tìm enzym coagulase liên kết: nhỏ một giọt nƣớc muối sinh lí trên lam kính, lấy nhiều khuẩn lạc vi khuẩn nghiền vào đó, tiếp theo nhỏ một giọt huyết tƣơng vào dung dịch.
Phản ứng dƣơng tính: sau vài giây tụ cầu tụ lại với nhau. Phản ứng âm tính: giọt nƣớc khơng có gì thay đổi
64
- Thí nghiệm xác định enzym coagulase tự do : Cho vào mỗi ống nghiệm nhỏ 1 ml huyết tƣơng đã đƣợc pha loãng 1/10 trong nƣớc muối sinh lý. Nhỏ tiếp nhiều giọt canh khuẩn đã đƣợc nuôi cấy qua đêm.
Lắc đều ống nghiệm và để ở 370C/6 h đem ra kiểm tra kết quả.
Nếu âm tính thì tiếp tục để 370C qua đêm. Sáng hôm sau phải đọc lại kết quả sớm để tránh hiện tƣợng âm tính giả do tụ cầu tiết ra enzym fibrinolysin sẽ làm hóa lỏng huyết tƣơng đã bị đơng.
Kết quả dƣơng tính: huyết tƣơng bị đơng chặt lại, âm tính khi huyết tƣơng lỏng. Thử nghiệm này cần đƣợc tiến hành song song với chứng dƣơng gồm huyết tƣơng + chủng chắc chắn là dƣơng và chứng âm là chỉ có huyết tƣơng.
Đọc kết quả theo bảng Sperber và Tatini Huyết tƣơng đông cứng sau 4-6 h,
khó di động 4+ Đƣợc xác định là S. aureus
Huyết tƣơng đông không chắc sau 6
h, dễ di động 3+ Không đƣợc xem là S. aureus
Không đông sau 24 h 2+ Không đƣợc xem là S. aureus
Đông thành cục nhỏ, không liên kết
khối 1+ Không đƣợc xem là S. aureus
Tất cả các chủng vi khuẩn sau khi đƣợc phân lập từ thực phẩm đƣợc đánh kí hiệu theo số để tránh nhầm lẫn với các chủng vi khuẩn chuẩn kiểm định (Bảng 2.2).
Bảng 2.2. Bảng kí hiệu các chủng vi khuẩn phân lập đƣợc trên thực phẩm
Salmonella Shigella E. coli S. aureus
65