- Mô phđn sinh chồị Củ
LAI TỂ BĂO SOMA
5.1. M ỏ ĐẦU
N hư ta đă biết, khâc với câc tế băo động vật, t ế băo thực vật ctí th ăn h tế băo lă lớp bao ngoăi cùng. Thănh tế băo gồm xenlulo (khoảng 20-30 % ), hemixenluỉo vă pectin. Nếu như th ăn h tế băo bị tâch bỏ, thì lúc đđ tế băo thực vật sẽ lộ ra lớp m ăng sinh chất ngoăi cùng, m ă trạ n g thâi ta gọi lă tế băo trăn hay protoplast. Khi câc protoplast tiếp xúc với nhau thỉ chúng cổ th ể hợp n h ất lại lăm một, m ă ta gọi lă 8ự d u n g hợp protoplast. Nếu như câc protoplast cđ nguòn gốc từ câc tế băo som a thuộc câc giống, loăi hoặc chi khâc nhau được dung hợp lại thi nó cđ th ể dẫn đến hiện tượng lai tĩ băo soma (somatic hybrydization),
Vi tế băo thực vật cố thănh tế băo, nín trước đđy trong một thời gian dăi người ta cho răn g kỷ th u ật dung hợp protoplđst chỉ giới hạn ở câc tế băo động vật; m ặc dầu ngay từ rấ t sớm K uster (1909) đă níu ra ý tưởng sử dụng phương phâp lai tế băo soma để vượt qua những khó khản nảy sinh trong quâ trìn h lai xa ở thực vật. Mêi cho đến nảm 1960, sau những nghiín cứu thănh cổng của Cocking với việc dùng m ột hỗn hợp câc
e m y m cellulose, pectinase vă maceroz3nne để tâch bỏ th ăn h tế băo thực vật, thi kỹ th u ậ t dung hợp protoplast mdi được âp dụng ở thực vật. Tuy nhiín, nổ chi thực sự phât triể n m ạnh m ế vă cố xu hiỉớng được úng dụng tro n g chọn giổng chỉ sau câc kết quả n ^ i í n cứu về việc tâi sinh hoăn chỉnh cđy thuổc lâ từ protopỉast của Ikkebe (1971) vă việc tâi sinh cđy thuốc lâ lai do dung hợp protoplast giữa hai loăi N. tabacum với N. langsdorffi
của Carlson (1972),
Sự r a đời của kỹ th u ậ t protoplast cho phĩp ngườỉ ta tẹo ra nhữ ng tâi tổ hợp di truyền giữa câc đơn vị phđn loại xa ( loăi hay chi) m ă bằng phương phâp ỉai hữu tính khò hoặc không đ ạ t được. Trong quâ trỉn h dung hợp, bín cạnh sự kết hợp giữa câc genom trong nhđn, còn cố th ể xảy ra sự hợp n h ất tế băo ch ất giữa câc protoplast. Nhờ vậy, m ột số tín h trạ n g do câc gen trong tế băo chất kiểm soât, như tính b ất th ụ đực, cố th ể được chuyển m ột câch không khó khăn từ cđy năy sang cđy khâc nhờ kỹ th u ậ t năỵ
Muốn tiến hănh lai tế băo soma căn phải tâch được câc protoplast m ột câch nguyín vẹn, cho chúng dung hợp với nhau, lăm cho câc sản phẩm dung hợp phđn chia vă tâi sinh chúng th ăn h cđỵ
5.2. TÂCH PROTOPLAST
Về nguyín tâc, có hai phương phâp tâch bỏ th ăn h tế băo thực vật : phương phâp cơ học vă phương phâp dùng enzyin. T\xy nhiín, trong thực tế người ta chỉ dùng phương
phâp enzym, vì nđ cd^hiệu su ẩt rấ t cao m ă lại không gđy thương tổn cho tế băọ
Khi thănh tế băo được tâch ra, protoplast phải được phóng thích ra môi trường cd âp su ất thắm th âu cao để trâ n h nước xđm nhập văo không băo, gđy vỡ protoplast ( ví dụ, cd th ể dùng dung dịch manitol 0,5 M). Tuy nhiín, thời gian lưu lại ở đó không nín quâ dăi khiến cho trao đổi chất của tế băo vă cấu trúc măng lưới sinh chất bị tổn hạị
Dể tâch protoplast, ví dụ từ cđy thuốc lâ được trồng trong nhă kính, được tưới thường xuyín ở 25"C, thỉ lâ thứ ba từ trín xuống lă ngiiồn thực liệu thích hợp nhất. Lâ được khử trù n g bằng ethanol 70% trong văi giđy, sau đó được nhúng văo dung dịch hypoclorit canxi 5% rồi rửa bằng nước cất. Lâ được thâi nhỏ cho văo đỉa P etri chứa hỗn hợp enzym như sau : 0,1 % cellulase, 0,02% macerozyme vă 0,05% driselase, để qua đím (khoảng 16 h). Sau đó lọc qua rđy cđ lỗ 50 - 80 /ym, rồi rửa 2 lăn băng dung dịch mới không chứa enzyxn bầng câch ly tđm.
Ngoăi lâ, người ta cd th ể dùng phần trụ dưới lâ mầm hay rễ lăm nguyín liệu tâch protoplast. Do không chứa diệp lục nín nguồn protoplast năy dễ phđn biệt với câc protoplast được tâch ra từ mô th ịt lâ. Một nguồn nguyín liệu khâc cũng được dùng để tâch protoplast lă câc tế băo nuôi cấy dạng huyền phù. Đôi với câc cđy hoă thảo, điều cần biết lă, chỉ cd câc protoplast được tâch ra từ câc tế băo phôi được nuôi cấy dạng huyền phù mới có khả nảng phđn chia vă tâi sinh cao (Fujimura,1985 ).