- Mô phđn sinh chồị Củ
học quan trọng ở cđy tròng lại do một số gen khổng liín kết với nhau kiểm soât vă sự
biểu hiện của chúng phụ thuộc văo câc giai đoạn p h ât triển khâc nhau của cơ thể. • C hỉ t h ị p h đ n tử : Chỉ thị phđn tử lă đặc điểm th ể hiện ă khía cạnh hoâ học hay cấu trú c phđn tử được di truyền lại cho hậu thế, giổng như câc nhđn tó di truyền Mendel, nhưng lại ctí th ể định lượng được. Cđ hai loại chỉ thị phđn tử cơ bản lă :
• Chi thị isozym
Isozym lă những dạng enzym có cùng m ột phản úng hoâ học như nhau (hoạt tính xúc tâc tương tự hoặc giống nhau) nhưng lại bị ức chế bởi những phđn tử khâc nhaụVề m ậ t di truyền, có th ể chia isozym lăm hai dạng:
Isozym đan gen : Câc isozym năy chịu sự kiểm soât của m ột gen; Mặc dầu chúng đều được hlnh th ăn h từ một chuỗi polypeptit đơn, nhưng có th ể ctí câc kiểu phđn tử khâc nh au ( như do sự khâc nhau về th ăn h ph ần vă tr ậ t tự axit am in; vă do vậy có th ể phđn tâch được bằng phương phâp điện di).
lsozym da gen : Câc isozym năy được m ă hoâ bởi hai hay nhiều gen vă chúng có th ể được phđn biệt bằng câc đặc điểm hoâ m iễn dịch hoặc bằng đặc tính enzym.
• Chl th ị phđn lử ADN
Khâc với hai loại chỉ thị hỉnh thâi vă chi thị isoz)Tn, câc chỉ thị phđn tử ADN rấ t
phong phú do sự đa dạng của ADN , tính ổn định vă sự khống lệ thuộc của chúng văo câc yếu tố mối trưòng. Câc chỉ thị di truyền phđn tử được sử dụng đế xâc định mối quan hệ giữa câc câ th ể trong cùng một loăi hoặc giữa câc loăi, lă cơ sở cho việc phân loại dưới loăi (câc thứ), phât hiện loăi mới vă mối quan hệ tiến hoâ giữa loăi (Đhn e t al.,1993; Dunforal et al.,1995). Chúng cũng có thể được dùng để lựa chọn ưỉ hợp lai (N air e t al., 1995; Zhang et al.,1995). Kiểu chỉ thị năy được sử dụng rấ t có hiệu quả đế lập bản đb phđn tử cho những cđy trồng có phương thức sinh sản sinh dưỡng hoậc sinh sản hữu tín h khtí khăn. Câc chỉ thị phđn tử được chia ra lăm hai nhđm lớn:
- Chí thị dựa trín cơ sò lai ADN hay chỉ thị RFLP. ư u điểm của phương phâp năy lă dựa trí n câc băng diện di thu được, ta khững những phât hiện được câc câ th ể dị hợp tử (Aa) vă đồng hợp tử (AA vă aa) mă còn phđn biệt được câ thể đồng hợp tử trội vối câ th ể đồng hợp tử lặn. v ỉ thế, người ta gọi chỉ thị năy lă chỉ thị đồng trộị Tuy nhiín, phương phâp năy cũng có nhược điểm lă qui trin h phức tạp, c&ng kềnh, khổ tự dộng hoâ, tốn kĩm vă phải sử dụng chất đồng vị phóng xạ nguy hiểm cho con ngườị
- Chỉ thị dựa trín cơ sô nhăn bản AD N băng kỹ th u ậ t PCR. Cho đến nay đả ctí r ấ t nhiều chl thị phđn tử được phât triển dựa trín cơ sở nh&Ti bản ADN bầng kỹ th u ậ t PCR, như AFLP, RAPD, SSR, STS ...
8.4.1. Chọn lọc nhờ văo chỉ thị ADN
Sự ra đời của câc chỉ thị phđn tử đê lăm tăn g hiệu iực của phương phâp chọn lọc nhờ chỉ thị. Câc chi thị ADN được dùng phổ biến n h ất lă RFLP. Về sau, người ta đă p h ât hiện ra nhiều loại chỉ thị ADN khâc. Trong chọn lọc nhờ chi thị, câc gen đích (gen cần được Đghiẽn cứu) được phât hiện lă dựa văo câc chỉ thị ADN chứ không phải lă dựa văo sự biểu hiện kiểu hinh của gen đó.
Hình 8.3. minh hoạ nguyín tâc vă cơ sở di truyền của việc xâc định m ột gen đích dựa văo câc chỉ thị. l ầ giả định rằng, một locut năm trí n m ột nhiễm sâc th ể của cđy lúa kiểm soât m ột tín h trạn g chống chịu với điều kiện bất lợị Cđy th ể cho (donor) chứa gen
khâng (R) liín kết với một gen chi thị ADN (m) vă cđy thể nhận (recipient) mang một alen khổng cđ khả nang khâng (S) Hín kết với một chỉ thị ADN (M). Sau khi lai giữa cđy
cho vă cđy nhận ta thu được cđy lai Fj dị hợp tử ở cả gen khâng (gen đích) vă ở locut chỉ thị ADN, như th ể hiện trín băng điện dị Cđy F j tự th ụ phấn sẽ cho ra quần th ể F2
phđn lỵ Dựa trôn phổ điện di của câc chi thị ADN, ta cđ th ể phđn câc câ th ể của quần th ể phđn ly thănh 3 nhóm MM, Mm vă mm. Trong nhổm mm phần lớn câc cđy m ang alen khâng (R) đo liín kết. Khi giâ trị r (khoảng câch giữa chỉ thị ADN vă gen đích) căng bĩ thỉ tỷ lệ câc cđy thuộc nhóm mm mang alen R sẽ căng lớn. Vì thế, chọn lọc dựa văo chi thị ADN cho phĩp chọn lọc được gen đích, trừ khi câc câ th ể được chọn lọc m ang nhiễm sắc th ể đă qua tâi tổ hợp. Nếu tần số tâi tổ hợp giữa gen đích vă chỉ th ị ADN khổng thay đổi tìl quần thể được lập bản đồ đến quần th ể chọn lọc thỉ ta cđ khả n ăn g chọn lọc được gen đích dựa trín câc chl thị ADN với m ột độ chính xâc caọ
8.4.2. Chọn iọc nhờ chỉ thị dựa văo PCR
Tính biến dị di truyền giữa câc giổng trong m ột loăi cđy cd th ể được p h ât hiện do sự sai khâc về chiều dăi của đoạn ADN đích được nhđn bản nhờ PCR khi sử dụng cùng m ột cập primer. Dó lă do sự thay thế bazơ nitơ ở câc điểm liín kết prim er hoậc do sự sâp xếp lại trậ t tự ADN trong vùng chứa câc điểm đó. Những sự thay đổi như th ế sẽ được phản ân h ă tính đa dạng về chiíu dăi câc đoạn ĐDN được nhđn bản (ampỉicon length 148 KỸ THUẬT PCR VĂ ỨNG DựMG CỦA NÓ TRONG CHỌN GIỐNG THựC VẬT
co sỏ DI TRUYỀN CHỌN GIỐNG THựC VẬT 149 thể cho I h ể n h ặ n m- X R- 7 1 licn kết (r) giữa gcn dích vă chi Ihị ADN
I
m --- M R---s
câc bđng chì thị ADN ờ câc căy bố mẹ
câc băng chi thị ADN ở căy lai Ki
ba kiểu gen chì thị mm, mM, MINI ở p2
gcn đích liín kết với kicii gcn mm
Hỉnh ».3. Sơ đd V? cơ xở di Iruyin cùa phuưng phâp chọn lọc nhờ câc chỉ thị phđn từ.
polymorphism = ALP). Khi ta không phất hiện được ALP giữa hai giống (trong hình 8.4.
lă giữa giống A vă giống B) băng một cập primer thỉ RFLP dựa trí n PCR (PCR based RFLP = PBR) cđ thể được sử dụng tiếp để ph&n biệt câc sản phẩm của PCR, nhờ việc dùng m ột enzym cât giới hạn do sự thay th ế bazơ nitơ ở điểm cât hay sự thay đổi tr ậ t tự nucỉeotit ở vùng giữa hai điểm cắt, cả ALP vă PBR đều lă câc chỉ thị dựa trí n PCR.
Câc prim er được dùng trong phương phâp chọn lọc nhờ chi thị dựa trí n PCR thường căn cứ văo câc điểm có trật tự nucleotit dâ dược xâc dịnh cd tín gọi tắ t lă STS.
Chi thị STS
Một kiểu chi thị di truyền hiện đang được sử dụng rất phổ biến tro n g việc lập bản đồ genom lă điểm trật tự dược dảnh dâu (Sequence Tkgged Si te = STSs). STS lă m ột đoạn ADN ngân gồm khoảng 60 - 1000 bp vă có thể phât hiện được bằng kỹ th u ậ t PCR. Nó cho phĩp xâc định những vị trí được đânh dấu bằng câch sử dụng câc trìn h tự nacleotit biết trước của ADN trong genom. Hai đoạn mồi được thiết k ế dựa trí n câc trỉn h tự nucleotit đả biết giúp ta xâc định được vùng ADN cần tìm kiếm. Câc đoạn mồi STS thừờng chứa khoảng 20 nucleotit (dăi hơn câc đoạn mồi trong kỹ th u ậ t RAPD) nín có tính đặc hiệu cao với PCR. Một lượng lớn STS có thể được tạo ra nhờ việc sử dụng kỹ th u ậ t RFLP vă câc dòng cADN lăm mẫu dò.
150 KỸ THUẬT PCR VĂ ỨNG DỤNG CỦA NÓ TRONG CHỌN GIỐNG THựC VẬT