- Mô phđn sinh chồị Củ
53. DUNG HỘP PROTOPLAST
Lần đầu tiín Carlson (1972) đê tâi sinh ra những cđy thuốc lâ từ protoplast băng câch cho dung hợp protoplast trong môi trường cfòng thẩm tích của dung dịch n itra t n atrị Còn Melchers (1974 ) thì dung hợp protoplast củng của thuốc lâ ở môi trường 50 mM Ca + 0,4 M m anitol với pH = 10,5. Môi trường của Melchers tỏ ra râ t thích hợp cho việc dung hợp tế băo chất. Sau năy, Kao (1974) đả phât hiện ra chât polyethylen glycol (PEG) cd tâc dụng lăm tđn g hiệu quă dung hợp của protoplast; vl nd lă chất qd âi lực với nước, lăm tăn g tính thẩm thấu vă tăng bề m ặt tiếp xúc giữa câc protoplast. Chỉ
sau văi phút được ngăĩh văo dung dịch 20 - 40 % (w/v) của PBG (mol. Wt. 1500 - 1600)
hău như tấ t că câc protoplast đều được kết dính lạị Tuy nhiín, việc dung hợp chỉ thực sự xảy ra khi pha ỉođng PEG trong môi trường có nồng độ cao vă pH cao (pH=« 10,5). T\iy nhiín, do PEG có độc tín h đối với tế băo thực- vật nín người ta thường dùng ở nồng độ thấp hơn vă thím văo đó m ột ít DMSO (dimethyl sulíoxid).
Sau năy, phương phâp dung hợp nhờ xung điện (electrofusion) do Zim m erm an đề xướng (1982) được nhiỉu người âp dụng. Nguyín tâc của phương phâp lă ; môi trường chứa protoplast được đặt giữa hai điện cực; sự dung hợp xảy ra khi ta tạo ra m ột xung điện với điện th ế cao ( 500 - 10000 v/cm) trong khoảnh khâc 5-6/1000 giđỵ
Với câc cđy họ că, hiệu quả dung hợp của phương phâp năy đ ạ t tới > 50%. Căn nhớ lă, hiệu su ất dung hợp phụ thuộc văo nhiều yếu tố: m ật độ protoplast, nhiệt độ khi thí nghiệm, nồng độ PEG, cường độ điện trường... vă nguồn nguyín liệu cho protoplast (tế băo mô th ịt lâ thường thích hợp hơn lă mô sẹo hoặc rễ cđy). Sự cd m ặt của m ột lượng lớn không băo vă câc h ạ t tinh bột lăm giảm khả nảng sống sơt của protoplast trong quâ trin h dung hợp. Dưối đđv (bảng 5.1) lă môi trường Bourgin (1979) dùng cho nuôi cấy protoplast được tâch ra từ th ịt lâ cđy thuốc lâ.