- Mô phđn sinh chồị Củ
câc kỹ thuật di truyền vă bước đầu chuyển được một Bố gen văo một văi cđy ttồng, như
đê xđy dựng được quỉ trinh bấn gen bằng súng Corbo-PIG văo mổ sẹo lúa với câc plasmid pMON, PRQ6 mang gen GUS vă khâng hygromycin; gen khâng bệnh bạc lâ vi khuẩn Xa21 cũng đê được bấn văo mổ sẹo câc giổng lúa CR203, C71 vă DRl, vă tỉí đd đê thu được hơn 300 dòng cđy tâi sinh từ mỏ sẹọ Việc xâc định sự hiện diện của gen Xa21 ở câc cđy tâi sinh tU câc mô được chuyển gen được tiến hănh nhờ kỹ thuật PCR ; dùng cặp mòi KUl: 5’. CGA TCG GTA TAA CAG CAA AAC-3V KIl: 5’-ATA GCA ACT GAT TGC TTG -3’ chạy PCR để nh&n đoạn kinase của gen Xa21 có kích thước l,4kb, nhăm săng lọc phđn tử từ dịch chiết ADN của cđy tâi sinh vă tim cây mang gen Xa21. Cđy chúa gen Xa21 lă những c&y khi được chạy điện di trín trín agarose 1-1,5% , cd xuât hiện bđng ADN với kích thước khoảng 1,4 kb - băng với đoạn ADN được nhđn lín từ mẫu gen Xa21. Sau đổ câc c&y năy còn được ph&n tích tiếp bằng phĩp lai Southern, nhờ viộc sử dụng CẬP môi lai K2F: 5’-GTG CTG GAA ATG GTA ACC -37 K2R: 5’ CCT GAG AGC AAG ACĐ ACC -3’ có kích thước 0,3 kb (Hoăng Kim Oanh vă c s , 1998).
Trong một nghiín cứu khâc, Nguyễn Đức Doanh vă c s (1998) đa sử dụng súng bắn
gen đế chuyển câc plasmid chúa gen mong muổn (gen GUS vă gen Xa21) cùng một lúc
với tỉ lệ 1/6 văo câc mỗ của giống lúa Ikipei 309 vă VL901. Từ đổ đê nhận được 35 dòng
Tkipei 309 vă 10 dòng VL901 chứa gen Xa21. Câc phản ứng hoâ mô đđ được thực hiện để xâc định hoạt tính của gen GUS; câc phđn tích PCR với cặp mồi Hl: 5’- CGT CGT
TCG AGA AGT TTC -3’ / H3: 5’ TAC TTC TAC ACA GCC ATC -3’, cho thấy sự có m ật
của gen khâng ạgromycin vă với cặp mồi XA21 3R: 5’- CGT CGT TCG AGA AGT TTC
-3’ / H3FRAGF: 5’- ATA GCA ACT GAT TGC TTG -3’ cho thấy sự hiện diện của băng 124 KỸ THUẬT CHUYỂN GEN VĂ ỨNG DỤNG CỦA NÓ. . .
ADN tương ứng với gen Xa21 ò câc cđy tâi sinh. Tuy nhiín, hai nhóm nghiín cứu trín tnới dừng lại ở mức xâc nhận sự tồn tại của câc gen được chuyển ở câc cđy tâi sinh, chứ chưa nghiín cứu được sự biểu hiện của chúng
Tuy nhiín, một cđu hòi được đặt ra lă, phương phâp năy liệu đê thực sự cd hiệu quă cao chưa ? Nếu chỉ xĩt ở hệ thống thực nghiệm lý tưởng lă câc tế băo phôi được nuôi cấy huyền phù thỉ, ở cđy ngô phương phâp năy cho ra tỉ lệ cđy hữu thụ cao hơn so với phương phâp chuyển gen trực tiếp văo protoplast. Tuy nhiín, phương phâp biolistics hình như chỉ giới hạn ở câc tế băo phôi được nuôi cấỵ Phương phâp biolistics sẽ gop phần văo việc tạo ra nhiều cđy được chuyển gen trong tương laị Song, có thể hiệu quả của nd chưa cao như ta mong đợị Vỉ răng, điíu năy không phải lă do hạn chế của vấn đề kỹ th u ật, mă
có th ể lă do câc yếu tố sinh học. Những loại cđy khó được chuyển gen nhờ vi khuẩn
Agrobacterium lă những cơ thể chứa rất ít tế băo cđ tiềm năng tâi sinh vă tiếp nhận sự kết gân câc gen lạ văo hệ gen của chúng. Bằng phương phâp biolistics ADN lạ cd th ể được đưa văo hệ gen của câc tế bêo năỵ Nhưng, khả nảng nhờ đd m ă gđy ra sự chuyển biến dương tính đối với câc tế băo năy cũng vẫn thật hiếm hoi (Potrykus, 1991).
Một ưu điểm lớn của phương phâp biolistics lă nó cho phĩp ta dễ dăng nghiín cứu được sự biểu hiện của gen được chuyển trong câc mô đê phđn hoâ (Goff e t al., 1990). v í dụ rõ răng về vấn đề năy lă việc phât hiện câc cđy đậu tương được biến nạp do xử lý biolistics đối với phần mô phía dưới đỉnh sinh trưởng của cây mầm. Những cđy con mọc lín từ h ạt của cđy đậu được xử lý năy đê được theo dõi để phât hiện ra những cđy được chuyển gen .
6.4.4. Phương phâp vi tiím dối với câc tế băo tiền phôi của hỢp tử hoặc củahạt phđn hạt phđn
Kỹ th u ậ t vi tiím sử dụng mây vi nhu động vă câc thiết bị hiển vi để đưa ADN văo tế băo, đă tạo ra được những cây chuyển gen từ protoplast (Chnorf et al., 1991) hoặc những cđy chuyển gen khảm từ câc tế băo tiền phôi có nguòn gốc từ hạt phấn ( N euhaus, 1987). Như phương phảp biolislỉỉs, phưaiìg phấp vỉ tỉíỉn chô phếp đưa ADN văo câc tế băo có thănh tế băọ So với phương phâp biolistics phương phâp xi tiím cd hạn chế lă nó
chỉ cho phĩp đưa ADN văo 1 tế băo cho mỗi lđn tiím; hơn nữa, phương phâp đòi hỏi kỹ năng cao vă th iết bị tốn kĩm. Song, nd cũng có một số ưu điểm lă: 1) lượng ADN đưa văo lă tuỳ ý; 2) ADN được đưa văo đúng chỗ; 3) việc đưa ADN văo đđu lă chính xâc, thậm chí cđ th ể tới nhđn tế băo; 4) đối với câc tế băo có cấu trúc bĩ như h ạ t phấn, phôi non, mă câc phương phâp khâc không âp dụng được thỉ kỹ thuật ví tiím cđ th ể đ ạt được; 5) kết hợp với kỹ th u ật nuôi cấy tế băo phôi non, phương phâp nảy cđ khả năng gđy ra sự biến nạp với bất kỳ loăi cđy năo có phương thức sinh sản hữu tính.
Băng kỹ th u ậ t vi tiím âp dụng cho câc phôi non được nuôi cây ở ngô, lúa, lúa mỉ, đậu tương, bông, hướng dương, thuốc lâ .. người ta đê gđy tạo được những cđy biến nạp ở dạng khảm - được xâc nhận qua sự cđ m ặt của những gen đânh dấu kỉm theo ( D đtta e t al., 1993). Tuy nhiín, những bằng chứng về hiện tượng biến nạp ở hậu th ế những cđy năy thì còn chưa xâc thực. Song, câc thỉ nghiệm như vậy cũng ch<0 thấy rầng, khả năng gđy biến nạp đối với câc tế băo phđn sinh lă rất thấp.
6.4.5. Nhứng phưong phâp thử n i^ iệm khâc
Cd hai phương phâp mới đang được câc nhă nghiín cứu thử nghiệm để chuyển gen. Dó l ă p h ư ơ n g phâp s ií u đm (ultrasonication) vă phưong p h â p x u n g điện (electroporation).
Băng siíu đm, người ta đă chuyển được ADN văo mô lâ của cđy thuốc lâ. Kết quả phđn tích cđy được chuyển gen cho thây, ADN lạ đđ được liín kếl văo hệ gen của cđy vă nố đê hoạt động. Tuy nhiín, người ta còn chưa thu được bằng chúng của sự biến nạp gen
ở kiểu hỉnh (Zhang et al. , 1991). ở đđy còn có điểm chưa rõ răng lă, cơ chế năo khiến cho siíu đm cd th ể chuyển được ADN qua thănh tế băo ?
Phương phâp dùng xung điện để chuyển ADN văo mô thực vật vă thu nhận được câc cđy biến nạp đă được tiến hănh thănh công lăn đầu văo cuối những nảm 1980, vă sau
năy ở cđy mía (Molina , 1992). Tuy nhiín, những bằng chứng cd sức thuyết phục của kỹ
thuật năy còn chưa nhiều vă người ta cũng chưa rõ về cơ chế hấp thụ ADN qua thănh
t ế b ă o .
Vậy lă, ta ctí th ể tạo ra câc căy trồng được biến nạp nhờ bốn kỹ th u ậ t :
(1) chuyển gen giân tiẵp qua Agrobacterium,] (2) hâp thụ ADN trực tiếp văo
protoplast; (3) kỹ thuật súng bân gen vă 4) kỹ thuật vi tiím.
Phương phâp (1) âp dụng cho những loăi cđy cd sự tâi sinh dễ dăng vă thưòng xảy