- Mô phđn sinh chồị Củ
B) Kasmid pRK2013 của EjcoIỈ được sử đụng đỉ gtóp cho việc đưa pĐlnỉ9 văo chủng Agrobacterium
Plasm id thứ hai đdng vai trò hỗ trợ, lă Ti-plasmid ờ tế băo Agrobacteriuniy m ă trong đtí toăn bộ vùng T-ADN ( kể că hai trật tự bi-ín) đê bị loại bò, nhưng vẫn còn vùng gen vir. Vùng gen vir năy đdng vai trò quan trong cho việc chuyển của vectơ nhị thể. Vi th ế plasmid thứ hai năy cđ tín gọi lă plasmid hỗ trự. Loại plasmid thứ n h ât sau khi được nhđn lín trong tế băo Ẹ coli thỉ được chuyển sang Agrobacteriiim chứa loại plasmid thứ hai băng quâ trìn h tiếp hợp.
Nếu như trong vectơ nhị th ể nói trín cd mang gen chi thị khâng kanam ycin (cd trong gen khảm Pnos-NPTII = promotor của gen nopaline synthase + gen khâng kanamycin N PTII) vă gen GUS (gen Ịỉ^ glucuronidase + đoạn kết nos m ang tín hiệu polyadenin hoâ), thi sau khi vectơ năy được biến nạp văo mô thuốc lâ, chỉ cd những tế băo nuôi cấy được biến nạp mới có khả năng sống sót trín môi trường chứa kanamycin. Vă sau đd, ở câc mô được tâi sinh từ câc tẽ băo được biến nạp, do có chứa gen GUS nín sẽ sản sinh ra /^-glucuronidase có khả nêng phđn huỷ X-gluc thănh một hợp ch ất tru n g gian m ă khi bị oxy hoâ sẽ tạo ra chất indigo có mău xanh đậc trưng. Nghĩa lă, băng m ột phản ứng hoâ mô ta cd th ể xâc định được sự hiện diện của gen GUS.
Nếu như so sânh hai hệ thống vectơ nói trín với nhau ta thấy răng giữa chúng ctí hai điểm sai khâc như sau: 1) ở hệ thống vectơ liín hợp, vùng T-ADN vă vùng gen vir cùng nằm trí n m ột plasmid (Ti-plasmid thể nhận); trong khi đó ở hệ thống vectơ nhị th ể thì vùng T-ADN nằm trí n vectơ nhị thể, còn vùng gen vir nằm trín plasm id hỗ trỢ; 2) trước khi được chuyển từ tế băo Agrobacterium sang tế băo thực vật thl ở vectơ liín hợp xảy ra sự hợp n h ất giữa Ti-plasmid thể nhận với vectơ trung gian băng quâ trin h trao đổi chĩo, trong khi đó ở vectơ nhị thể thl sự hỢp nhất đđ không xảy rạ
• Câc kếí quả nghiín cứu vỉ biẽn nạp ờ căy một lâ mầm
N hư đă ndi, quâ trìn h biến nạp có liín quan đến Agrobacterỉum chỉ xảy ra b ât đău ở bộ phận của cđy bị thương tổn. Nói khâc đi, sự xuất hiện câc vết thương tổn lă điều kiín tiín quyết cho sự xđm nhập vă sau đố lă sự biến nạp do vi khuẩn gđy rạ 'Riy nhiín, câc cđy vă câc phăn mô khâc nhau trong một cđy cũng có phản ứng khổng giống nhau với sự thương tổn. Những cđy không chấp nhận sự biến nạp thường không cd phản ứng với sự thương tổn. Câc cđy hoă thăo thuộc loại như vậỵ Mặc dđ^ đê cd r ẫ t nhiều nghiín cứu được tiến hănh với nhóm cđy năy, song cho đến nay, nhữr^g kết quả thu được mới chỉ lă bước đăụ Cần lưu ý răng, khả năng gđy biến nạp đối với cđy m ột lâ m ầm lă khổng khđ; điều năy chỉ khó khi ta dùng vectơ biến nạp lă AgrobacẾerium\ vl ndi chung, câc tế băo cđy hoă thảo không cd phản ứng với câc vết thương như ở phằn lớn cđy hai lâ mầm. (Cđy m êng tđy - Asparagus - mặc dău thuộc nhóm cđy một lâ mầm, nhưng cd phản ứng với vết thương nín dễ gđy biến nạp băng Agrobacterium giống như cđy hai lâ m ầm). Tương tự như vậy, loại cđy hai lâ mầm không cd phản ứng thích hợp với vết thương (ví dụ câc cđy họ đậu) củng rấ t khó gđy biến nạp như cđy hoă thăọ
Tạỉ sao ở cđy hoă thăo việc biến nạp do Agrobacterium lại khđ khăn như vậỷ Đó lă do, vết thương ở cđy hoă thăo rất khó dẫn đến sự phđn hoâ của câc t ế băo bín cạnh vă không khiến cho câc t ế băo năy thực sự cd khả nđng tâi sinh vă tiếp n h ận sự biến nạp. Ngược lại, câc tế băo kề gần vết thương lại tích luỹ nhiều phenol vă bị chết. Một số nghiín cứu cho thấy rằng, T-ADN được chuyển văo câc tế băo bín cạnh vết thương (Grimsley, 1987). Diều khó hiểu hơn lă, câc thỉ nghiệm với câc mô phđn sinh gồm câc tế
băo rấ t dễ tâng sinh vă dễ nuôi cấy in vitro, cũng không tạo ra được câc dòng vă câc cây biến nạp. Bí m ật của vấn đí năy không phải lă do bản thđn Agrobacterium (nó truyền T-ADN văo hoă thảo) hoậc loại cđy chủ (trong đó cđ hoă thăo) mă lă khả năng có được tính tâi sinh vă chấp nhận sự biến nạp của cđỵ Lại cd một số giă thuyết giải thích sự khó hình thănh khối u hoặc lông tơ ở câc loăi cđy m ột lâ mầm lă do: khd có sự gân kết của vi khuẩn văo thănh tế băo của cđy (Rao et al., 1982), hoạt tính của prom otor T-ADN bị giảm (Graves vă Goldman, 1982), sự săn sinh của gen vir bị ức chế, vă sự m ất cđn bằng auxin / cytokinin (Schảer, 1987). ĩ\xy nhiín, theo Potrykus (1990) thì nguyín nhđn cơ bản lă do, cđy một lâ m ầm không có hoặc có phản ứng yếu với sự thương tổn, nghỉa lă thỉếu hiện tượng tăng sinh để hình th ănh m ột quần th ể tế băo lớn từ câc tế băo sâ t vùng bị thương tổn.
Mêi cho đến năm 1986, Graves vă Goldmann mới thông bâo ví những kết quă bước đầu về gđy biến nạp đối với câc cđy ngô non, nhưng còn thiếu những băng chứng thuyết phục. TVong thời gian gần đđy, kỹ th u ật biến nạp giân tiếp nhờ Agrobacterium đă được thử nghiệm thănh công ở niột số cđy hoă thăo như lúa (Hiei, 1994; Rashid,1996; Khush vă D atta, 1996; Veluthambi, 1966; Hall, 1997) vă ngô (Ishida, 1996). ở cđy lúa, hiệu quả biến nạp phụ thuộc văo khă năng tâi sinh trong nuôi cấy mô. Một sổ giống lúa như Basm ati 122 hoặc câc dòng IR51500 vă IR58 thuộc nhóm Indica vă dòng T309 thuộc nhóm lúa ưaponica lă có khả năng gđy biến nạp được. Khi nghiín cứu với câc giống lúa
Indica, Khush vă D atta (1996) đê sử dụng chủng Agrobacterium LBA4404 ( f TOK333).
Nó chứa gen virB, virC vă virG từ Tiplasmid pTiB0542, intron-GUS (một gen khâng hygromycin - hph ) vă 1 gen khâng kanamycin. Câc tế băo phôi ở dạng huyền phù được dù n g lăm đối tượng để gđy biến nạp; môi trư ờ n g nuôi cấy được bổ sung thím acetosyringone ( 200M), đật ở 26 - 28*'C. Kết quả phđn tích cđy tâi sinh cho thẩy, sự biểu hiện của gen GUS m ang tính chất khảm (trong khi một số cđy cd biểu hiện thì m ột số cđy khâc lại không có biểu hiện của gen GUS).
ở Việt Nam, trong thời gian từ sau 1996 đê cđ m ột số nghiín cứu nhằm tiếp cận với phương phâp gđy biến nạp hầTìg Agrobaủterium ở cđy lúê. Hòăng Kim O anh vă c s (1998) đê tâch chọn vă xâc định được một câu trú c gen Bt nằm trong pGEM- 4Z, gồm 35S prom otor + CrylĂb) + NOS -term inator. Gen năy sau đđ đê được lắp râ p th ăn h công văo Ti-plasmid pC1301 từ chủng Agrobacterium tumefaciens EHA105 vă được dự định biến nạp văo mô sẹo một số giống lúa Việt Nam để gđy tạo nín câc dòng lúa có tính khâng sđu đục thđn. Trong khi đd, Nguyễn Dức Doanh vă c s (1998) đă sử dụng dòng
Agrobacterium tumefaciens GV3850 chứa plasmid p K C H ie m ang gen khâng kanam ycin vă gen chitinase khâng nấm Rhizoctonia solani để gđy biến nạp văo mô sẹo câc giống lúa DTIO vă DT13. Sau 3 chu kỳ chọn lọc câc chòi sống sdt trín môi trường chủa 25 mg/1 kanam ycin, câc cđy tâi sinh được kiểm tra về sự cd m ặt của gen GUS băng phản ứng hoâ mô. Còn sự cd m ặt của gen chitinase thì được xâc định băng kỹ th u ậ t phđn tích PCR với cặp mòi đặc trưng cho chitinase của Phaseolus vulgaris lă VN l: 5*- CCA TAT GAA GAA GAA TAG GAT GAT G -3’ / VN2: 5’ - ATG ATG ATC GAG AGG TGA CAA GGT C-3’. Dồng thời, băng việc sử dụng chủng Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 cố chứa plasm id pTOK233 m ang gen khâng hygromycin, gen GUS vă cấu trú c p35S- CryIĂb)-NOS, nhổm tâc giả năy củng đê th ăn h công trong việc gđy biến nạp ở dòng bắp cải CB26. Sự có m ặt của gen GUS vă gen Bt [(CrylĂb)] đă được lăn lượt kiểm tra băng 122 KỸ THUẬT CHUYỂN GEN VĂ ỨNG DỤNG CỦA NÓ. . .
phản ứng hoâ mô vă kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc trưng C R l: 5 ’ - CAA GCT GCT AAT
T Ĩ A CAT TTT TC .37 CR2: 5’ - GAT CAA TAT GAT CCG TCẠ -3’. Tuy nhiín, câc kết quả thu được từ hai nhđm nghiín cứu ndi trín mới chỉ xâc nhđn được sự tồn tại của câc gen được chuyển ở câc cđy tâi sinh, chứ chưa chứng minh được sự hoạt động, tức sự biểu hiện của chúng.
6.4.2. C h u y ể n g en trự c tiếp văo p ro to p la s t
P rotoplast có thể coi lă một đối tượng lý tưởng để chuyến gen. VI rằn g ADN ( vă ngay cả protein hay câc cơ quan tử của tế băo) có thể xđm nM p rấ t dễ dăng văo trong tế băo đă không còn thănh tế băo ; vă lại, điều đó có thể xảy ra đối với b ấ t kỳ n&ng độ protoplast năo vă của thực vật năọ Việc tâch thănh tế băo (bămg cơ học hay bằng enzym) đều tạo ra m ột phản ứng thương tổn đối với tế băo vă chuyển chúng sang trạ n g thâi cd khả nảng tâi sinh vă chấp nhận sự biến nạp. Việc chuyển gen như vậy không cần m ột vectơ sinh học năọ ở đđy, ADN được hấp thụ bằng một quâ trỉn h v ật lỹ đơn th u ầ n vă loại bỏ được giới hạn giữa câc nhóm thực vật. Vì thế, phương phâp năy thường được gọi lă phương phâp chuyển gen trực tiếp vă được âp dụng cho những cđy m ă phương phâp chuyển gen giân tiếp qua Agrobacterium (như hoă thảo) khỏn.g th ự c hiện được.
Quâ trìn h hấp thụ ADN văo protoplast có thể được tâng cường nhờ việc xử lý bằng polyethylene glycol (PEG) hoặc băng xung điện ( electroporation). Sở dĩ như vậy, vl PEG lă ch ât có âi lực với nước; ở nòng độ cao, PEG lăm cho ADM cần được biến nạp khổng còn ở trạ n g thâi hoă tan nữa, mă kết dính văo măng sinh chất của protoplast để được chuyển nạp văo phía trong. Còn khi xảy ra câc xung điện thì t.ríai bề m ặt protopỉast xuất hiện tạm thời câc lỗ có đường kính khoảng 30 nm, mă qua đó ADN cần được biến nạp sẽ xđm nhập văo protoplast. Muổn vậy, người ta sử dụng một th iế t bị tạo ra xung điện trong m ột khoảnh khâc 5 - 6/ 1000 giđy ở điện thế cao; protoplast được đ ật giữa hai tâm kim loại câch nhau 1 - 4 mm trong một cuvet nhựạ
Bằng phương phâp năy, người ta thấy việc chuyển gen rất có hiệu quả vă dẫn đến việc di truyền ổn định của một !oệỉ gen đơn. Vậy, phải cbảmg phương phâp gđy biến nạp năy không cd khd khăn gì ? Trong thực tế, mỗi protoplast cơ khả n ân g bị biến nạp khỡng giổng nhau; việc tâi sinh cđy từ prơtoplast rất công phu vă chịu tâc động của nhiều nhđn tố môi trường. Nđ cũng phụ thuộc văo loăi cđy vă phăn ứng vớí sự thương tổn cũng như khả nâng tâi sinh của từng loăi cđỵ Với một số cđy hoầ thảo quan trọng m ă khd hoặc không th ể gđy biến nạp được nhờ Agrobacteriumy thì ngăy nay người ta đê thănh công bầng phương phâp năy, như ở loăi lúa phụ daponỉca (Datta et al., 1960), ngô (Doim et al.,1990), lúa mì (Vasil, 1992). Tuy nhiín, củng căn nói rầr^g, cho đến nay kỹ th u ật chuyển gen đối với câc cđy hoă thảo vân chưa phải lă thổng dụng.
6.4.3. C h u y ể n g en b ă n g sú n g b â n gen
Trong những năm cuối của thập kỷ 80 người ta đê cho ra đời m ột phương phâp tạo gia tóc cho những hạt nhỏ cố mang ADN băng một công cụ gọi llă súng bắn gen ( particle gun hay gene gun). T\iy nhiín, hiện nay kỹ thuật năy cd một số tí n gọi khâc nhau như: chuyển nạp sinh học (biolistics), bom vi tiíu (microprojectile boimbardeinent), gia tóc h ạ t (particle acceleration) hay bom hạt (particle bombardement), m ặc dầu nguyín lý chung của nđ chỉ lă : sử dụng luòng khí helium âp lực cao (3500 psi) để bắn câc h ạt bụi văng
(hoặc volíram) được bọc ngoăi băng ADN văo khối mô đặt phía trước luống "đạn". Băng công cụ năy, người ta cđ thể đưa gen văo tât cả câc kiểu tế băo vă mô. Năm 1987 Klein lă người đầu tiín sử dụng kỹ thuật năy đế chuyển gen văo tố băo biểu bỉ thuốc lâ.
TVong thực tế, phương phâp năy cđ nhiều ưu điểm vă tính khả thi cao; ví như 1) thao tâc dễ dăng; 2) cổ thể chuyển câc gen văo nhiều t£ băo ; 3) tế băo cđ tỷ lộ sổng sòt cao; 4) câc gen giữ nguyín được hoạt tính của chúnỉp, 5) câc tế băo được nghiín cứu gồm nhiều chủng loại, như hạt phân, tế băo nuổi cây, tế băo trong câc mỗ đa phđn hoâ vă mổ ph&n sinh; 6) *đạn ' cổ thố d bỉ mặt hoặc *gêm* sđu văo câc cơ quan. Tuy nhiẽn, qui trình thực hiện của phương phâp năy chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố môi trường. Ndi
t d m l ạ i , p h ư ơ n g p h â p n ă y c h o p h ĩ p đ ư a c â c g e n v ă o n h i ề u t ế b ă o ở v ị t r í m o n g m u ố n m ă
khỏng cần những đi%u kiện thí nghiệm quâ phúc tạp.
Những cđy đậu tương được chuyển gen lần đầu tiín b&ng phương phâp năy vă băng
Agrobacterium đều văo năm 1988 (Hinchee et al. ,1988; Mc Cabe et al., 1988). 1\iy nhiín, cho đến nay, phương phâp năy vẫn được nhiSu người ưa sử dụng vă được đânh giâ lă thănh công hơn lă nhờ Agrobacterium (Christou, 1992, 1996). Nhờ phương phâp năy người ta đê gêy tạo ra dòng ngổ được chuyển gen hữu thụ (Fromm et al., 1990). Với