- Mô phđn sinh chồị Củ
KỸ THUẬT RPLP TRONG NGHIÍN cứu DI TRUYỀN VĂ CHỌN GIỐNG THựC VẬT
7.1. ĐẠI CƯONG VÍ RFLP
Trong cơ thể thực vật, thông tin di truyền được mả hoâ trong câc gen. N hững gen năy năm trí n phđn từ ADN của nhiễm sâc thể trong nhđn hoậc của một số cơ quan tử ngoăi nhđn. Ndi chung, trong câc cơ thể sống, khả nảng sao chĩp của những phđn tử ADN đd xảy ra với độ chính xâc cao vă nhanh chóng. Tuy nhiín, có một só cơ chế khâc lại có th ể gđy nín những sự thay đổi trong phđn tử ADN ở mức độ nhỏ, như lă những sự thay đổi xảy ra ở câc cặp bazơ nitơ, hoặc ỏ mức độ iởn hơn, như lă câc hiện tượng thím hay bớt một đoạn gen năo đd.
Lượng ADN cd trong một tế băo thực vật lă rắt lớn. Mặt khâc, trong tự nhiín, ở câc quăn th ể thực vật. lại tồn tại tính đa dạng cao độ về cấu trúc ADN. Vỉ thế, không cd hai cơ th ể năo có sự giống nhau hoăn toăn v'í trậ t tự phđn bố câc bazơ nitơ trí n ADN.
Tính biến dị tự nhiín ví trình tự nucleotit của phđn từ ADN có th ể được phât hiện băng một số phương phâp. Một trong những phương phâp đd lă xâc định trự c tiếp trình tự nucleotit của ADN vă tiến hănh những so sânh chi tiốt. Tuy nhiôn, phương phâp năy khâ phức tạp vă tốn nhiều thời gian. Hiện nay, có một phương phâp khâc nhằm xâc định có hiệu quả tính biến dị cùa ADN \ầ MÙ dụng một nhóm nnxyin đặc hiệu gọi lă enzym giới hạn. Những enzym năy được sản sinh ra từ nhiều loại vi sinh vật khâc nhaụ Chúng cd khả năng nhận biết những vị trí "đích" hay còn gọi lă những vị trí giới hạn, chứa một tr ậ t tự nucleotit đặc thù trong ADN vă sau đó cât ADN tại trậ t tự dó, Vì vậy, m ột đoạn lớn của phđn tử ADN sau khi được xử lý bởi enzym năy sẽ bị cât thănh nhỉẽu m ảnh nhỏ có kích thước khâc nhaụ Số lượng vă kích thước của chúng sẽ phăn ânh sự phđn bổ của những vị trí bị cât trong phđn tử ADN. Sự hiện diện của câc đoạn cắt năy m ang tín h đặc trư n g cho từng tổ hợp ADN / enzym giới hạn. Vỉ thế, có thể sử dụng những m ảnh cât năy như lă câc "dấu vđn tay" đặc trưng đối với từng phân tử ADN (hoặc đổi với cơ thể có chứa phđn tử ADN đó),
Sự khâc nhau về kích thước của câc phđn đoạn được tạo ra do xử lý enzym giới hạn đối với câc phđn từ ADN trong nhân hoặc trong câc co quan tử khâc n h au được gọi lă
tính đa hình chiều dăi phăn đoạn cât giói hạn (restriction fragment length polymorphism = RFLP). Người ta có th ể sử dụng RFLP như lă một sự đânh giâ trực tiếp tính biến dị di truyền của sinh vật. Những phđn từ ADN nhỏ (như ADN trong lạp thể) khi bị xử lý bởi m ột kiểu enzym giới hạn đặc trưng, như EcoRI, thường bị cât ra thănh khoảng 40 đoạn nhỏ khâc nhaụ Những phđn đoạn như vậy có thể được phđn lập ra bằng câch chạy điện
130 KY THUẬT RFLP TRONG NGHIÍN cứu DI TRUYỀN . . .
di trín gei agarosẹ Nhò nhuộm mău gel băng ethidị bromua, tính đặc thù của câc đoạn năy ctí thể được quan sât trực tiếp hoặc chụp ảnh qua mây soi ADN.
Nhiều nghiín cứu đa sử dụng RFLP đối với ADN của lạp thể để tỉm hiểu sự phât sinh chủng loại vă hệ thống học trong rất nhiều nhổm thực vật khâc nhaụ Trong khi đố, việc sử dụng ĐDN lạp thể trong chọn giống thực vật vẫn còn nhiều hạn chế. v i rằng, hầu hết câc gen cổ ỉiín quan đến câc tính trạng nững học quan trọng đều nằm trín nhiễm sấc thể của nhđn, chỉ cố một số ít lă nằm trín ADN của lạp thể.
Quâ trình phđn tích RFLP cũng cd thể được âp dụng đối với ADN nhiễm sâc thể, nhưng khó khăn hơn, vl ADN của nhđn cố cấu tạo rất phức tạp. Việc xử lý ADN nhđn của thực vật bậc cao bằng một loại enz3on giỗi hạn đặc thù sẽ tạo ra hăng triệu mảnh ADN ctí kích thưốc rât khó phđn biệt. Nếu chạy điện di trín gel agarose vă nhuộm mău bầng ethidi bromua thì không dễ gì nhận ra được những sự khâc biệt giữa chúng. Vi thế, ta sẽ nhận được một hình ảnh như lă một dải liín tục gốm nhiều vệt đậm. Mặc dù vậy, một số phđn đoạn vẫn ctí thể được phđn tích tốt trín gel vă việc sử dụng kỹ thuật RFLP vẫn ctí thể giúp ta phđn biệt được ADN giữa câc cơ thể khâc nhaụ Việc sử dụng những kỹ thuật phức tạp hơn sẽ giúp ta giải quyết được vấn đề năỵ Đó lă câc kỹ thuật tâch dòng probe (mẫu dò) vă lai ADN.