- Mô phđn sinh chồị Củ
100 LAI TẾ BĂO SOMA
5.4. NUÔI CẤY PROTOPLAST VĂ TÂI SINH CĐY
Môi trường nuôi cấy protoplast khâc xa so với câc môi trường nuôi cấy mô đ ể cho tế bâo cổ th ể phfln chia vă hinh th ănh md sẹọ Điều khâc trư êc tiín lă, mổi trư dng năy cần phảỉ cd âp suăt thẩm thđu cao lúc ban đầu bầng câch aử dụng m annitol hoặc sorbitol ; thứ hai lă, môi trường phẩd ctí nông độ chất sinh trưởng tương đổi caọ Đối với protoplast thuổc lâ nồng độ câc chất đổ lă : 3 mg/1 NAA (15 Ịiim.) vă 1 mg/ỉ benzylam inopurín (5
/im ) - Xem bảng 5.1. M ật độ protoplast / ml phải điều chỉnh sao cho cd th ể đếm được bầng bu&ng đốm hồng cầụ Vối thuốc lâ, nồng độ đó lă 60000 protoplast /ml (nốu tế băo cđ kích thước bĩ thỉ m ật độ ctí th ể tAng lín). Môi trường dịch th ể của protoplast cần đ ật
trong điều kiộn tổi cho đến khi chứng b&t đ&u phftn chia l&n thú nhât. Sau đổ kho&ng tìỉ
2 -6 ngăy thỉ th ănh tế băo được tâi sinh (tùy theo loăi cđy). Cấu trú c 2 tế băo cố th ế quan s â t được dưới kính hiển vi soi ngược, nếu chúng được nuôi cấy trí n môi trường lỏng. THỉy nhiín, nếu nuôi cấy trôn môi trường đặc thl ta có th ể theo dõi được sự p h ât triể n của từng protoplast vă sự hinh th ăn h từ n g cụm t ế băo bĩ cđ nguồn góc từ từ n g protoplast.
Đ ể chọn lọc câc đột biến sinh hoâ hoậc câc con lai soma ngưdi ta cổ th ể nuỗi cẨy tâch riíng từng protoplast trín từ ng đĩa P e tri nhỏ trong mối trường cổ n&ng độ auxin th ấp vă m ật độ tế băo thấp (1 tế băo / Iml). Với protoplast của cđy cải dầu, băng phương phâp nuôi cấy liín tục cđ thay môi trường mới 2-3 lần thì có th ể thu được câc nhổm tế băo cổ kỉ}ả n&ng tâi sinh, sau khi chuyển chúng san g mối trường đặc tạo ch&ỉ thđn.
Cổ hai con đường phât sinh hình thâi tro n g quâ trin h hình thănh cđy hoăn chỉnh đối với câc t ế băo cd nguồn gốc từ protopiast. Đối với câc protoplast cđ nguồn gốc tỉl mỏ th ịt ỉâ của cđy thuốc lâ, thỉ từ trong câc tậ p đoăn t ế băo nhỏ xuất hiện những u 16i ( văi tu ầ n sau khi tâch protoplast). Câc u năy phât triể n th ăn h rễ trong mổi trường khổng có chât sinh trưởng hoặc có ít auxin. Còn trong trư ờ ng hỢp khi protoplast có nguồn gốc từ câc
tố băo phôi được nuôi cẩy dạng huyền phù ( thưòng đổi với họ hoă thảo ) thi câc cụm tố băo v&n giữ nguyẽn được khả n&ng phât sinh phối để hinh thănh nín câc phổị Nếu đảm bảo được qui trìn h chặt chẽ như trín, thi phồi hoặc mô phđn sinh sỗ hỉnh th ăn h sau khoảng 3 -5 tu ầ n lễ. Tuy nhiín, trong những trường hợp khi mă điều kiện th í n i^iộ m khống tổi ưu vă có những biến đối về mặt di truyền thỉ sẽ xuât hiện sự thay đổi VẾ sổ lượng nhiễm sâc th ể. Ví dụ, với câc protoplast từ cđy khoai tđy 2n, tầ n số cđy 2n được tâ i sinh chỉ khoảng 10%, còn lại chủ yếu lă câc cđy 4n.
5.5. CHỌN LỌC SẤN PHẨM DUNG Hộp
Giả sử ta cho dung hợp giữa câc protoplast từ 2 cđy khâc nhau vă thu được kiểu tế băo dị nhđn (heterokaiyocjrte), trong đó có sự trộ n lẫn cả nhđn vă tế băo chất (bao gốm cả ty, lạp th ể trong tế băo chẫt ). Song, sự dung hỢp năy cũng có th ể chỉ xảy r a giữa 2 nhên hoậc giữa câc tế băo chất hoặc chi một phần giữa câc nhđn. Điều năy phụ thuộc văo quan hệ giữa câc loăị Ví dụ, tăn số dung hợp giữa N.tabacum / N.tabacum ỉă 10 ■*, giữa Brassica campetris / B. oleracea lă 0,5. Dể lăm tăng khả năng tâi sinh câc cây lai, người ta đê sử dụng một số phương phâp lăm tản g tỷ lệ câc tế băo dị nh đn hoậc câc phương phâp chọn lọc tế băo laị
Dưới đđy, ta xem xĩt một sổ kỹ thuật tâch câc sản phẩm dung hợp.
1) Gleba (1978) đề xuất kỹ thuật tâch vă ũh&n dòng đổi với câc sản phẩm dung hạp dưới kính hiển vi, dựa văo sự sai khâc về m ặt hinh thâi; chẳng hạn sự cổ m ặ t của câc chloroplast từ protoplast của mô thịt lâ vă sự khũng cổ m ặt của chúng tro n g câc protoplast cd nguồn gốc từ mô sẹo hay trụ dưới lâ mầm. Việc tâch câc tố băo dị nh ân được tiến hănh bằng micropipet.
2) G albraỉth (1978) vă Redenbaugh (1981) đS ra phương phâp nhận diện câc sản phẩm dung hợp bằng câch nhuộm huỳnh quang hoặc với chất rhodam in isothiocyanat đối với câc protoplast trước lúc cho dung hợp.
3) Câc sản phẩm dung hợp cũng có thể được tâch ra băng phương phâp kốt hợp tìí
trường với gen chỉ thị khâng ehẵt khấHg ẫÌRh. Nguyín tấc nhu ẫêu; protoplast của dạng
A được gân những phđn tử nhỏ cố âi lực tỉí tính mạnh; protoplast của dạng B có gân gen khâng chất khâng sinh (ví dụ như kanamycin) Sau thí nghiệm dung hợp, protoplast được cho đi qua cột phăn ly ctí từ tính mạnh; protoplast dạng A vă protoplast lai được gỉữ lại ở cột, còn prỏoplast dạng B thỉ tâch khỏi cột. Hỗn hợp protoplast lai vă dạng A được nuổi căy tro n g mổi trường có kanamycin để tâch ra câc tế băo laị
4) Câc hiện tượng bổ sung di truyền trong quâ trinh dinh dưỡng được dùng r ấ t rộng rêi vă cđ hiệu quả để nhận biết câc sản phắm dung hợp, như sử dụng câc đột biến bạch tạn g hay thiếu h ụ t diệp lục, câc đột biến sinh hoâ do thiếu enzym n itra t reductase - NR (Melchers, 1974; Glỉmelius, 1978 ) hoặc câc gen đânh dấu (ctí được bằng phương phâp chuyển gen) có liín quan đến tỉnh khâng câc chât khâng sinh (Hamil, 1984) hoặc khâng chất diệt cỏ (Evola, 1983).
- C hẳng hạn, cđ những trưòng hợp, khi được nuôi cấy tro n g môi trư ờ n g thiếu hoocmon ngoại sinh thi câc tế băo lai có khả nêng cho mỏ sẹo vă tâi sinh cđy, còn câc tế băo của từ n g dạng bó mẹ lại không có khả năng ấy (Power (1977) vă Shenck (1982)) .
- Trong nghiín cứu của Cocking (1977), khi dung hợp protoplast giữa câc dạn g đột
biến thuộc hai ioăi Petunia hybrida vă p. parodii, tro n g đổ protoplast từ dạng đột biến albỉno của p. hybrida cho md sẹo m ău trâ n g trí n mối trư òng m ă d đd protopỉast của p. parodii khống cho mữ sẹo, còn tế băo lai thì cho mỗ sẹo m ău xanh.
• Masson (1989) vă Thomas (1990) đ a sử dụng phương phâp biến nạp cho cả hai dạng bố m ẹ : m ột dạng được g&Đ gen khâng k an am y d n còn dạng kia được gân gen khâng hygrom ydn; việc chọn lọc câc tế băo lai được tifo hăn h trong mữi trường chứa cả hai loại khâng sinh đđ.
N ếu m ột trong hai dạng bổ mẹ lă kiểu đột biến sinh dưỡng, ví dụ, kiốu thiếu enz}an N R nĩn khống th ể sổng được tr6n mỗi trư ờ ng N O ^d o khống có khả năng khử N O ^ -*■ N 0J" -* NH3, còn dạng kia được chuyển gen kiểm soât m ột tính trạ n g trội - như kiểu khâng chất diệt cỏ hoặc khâng sinh - th i ta cổ th ế chọn lọc trực tiếp câc tế băo lai trí n mỗi trường tổi thiểu vă cổ bổ sung chêt khâng sinh hoặc chất diệt cỏ (câc tế băo bổ hoặc mẹ khổng thổ sỔBg binh thườhg được). D ạng con lai đ a năng như vậy đa được sử dụng d cđy thuổc ỉâ hoặc cải d&ụ