- Mô phđn sinh chồị Củ
118 KỸ THUẬT CHUYỂN GEN VẦ ÚNG DỤNG CỦA NÓ gỉữa hai trậ t tự biẻn Để giải quyết khd khản năy, người ta đđ thiết kế ra hai hệ thổng
vectơ khững gầy khối u, khâc nhau ở chỗ : vùng gen vir vă hai trậ t tự biín (LB vă RB) cùng n&m trẽn m ột đơn vị tâi bản (plasmid ) hay trí n hai đơn vị khâc nhaụ Đó ỉă hộ thổng vectơ liín hạp vă vectơ nhị t h i (hỉnh 6.6).
• Hệ thống vectơ liín hợp (co-integrate vector)
Dđy lă sự hợp nhất của văi ba loại plasmid khâc nhau tníớc khi nó được biến nạp
QQQAGATCTAAGCTTCCCCGQQTACCQCQQTCQACQGCCQAỠTACTBglll Smal Sctll Xnvyil Bglll Smal Sctll Xnvyil HMIIi Kpnl iQACAQGATATATACCQneTMrnĩGTCQ ■ ầ — RíOni D0f09r Sall Seal \ Xmalll ^ 1
sang tế băo thực vật. Tk sẻ xem xĩt một dạnịg vectơ liín hợp điển hình lă pVG3850 do Zambiy3ki thiốt kế năm 1983 - hỉnh 6.7.
Hệ thống năy gồm hai plasmid :
Plasm id thứ n h ât lă Ti-plasmid thể nhận pVG3850, có nguồn gổc từ pTiC58. Nd chứa vùng gen vir, vùng T-ADN mă ngoăi hai đoạn biín LB vă RB cùng m ột sổ gen chi thị được giữ lại, còn thi bị loại bỏ hết (vi thế lchững còn kJỉả n.ăng g&y ra khối u) vă được thay th ế văo đổ lă m ột đoạn tương (fòng với đoạn có trín plasmid thứ hai (gọi lă plasmid tru n g gian). Doạn được đưa văo thay th ế năy thực ra lă m ột plasm id nhỏ pBR322 của vi khuẩn Ẹ colị
Plasm id thứ hai (plasmid trung gian) pVGlỉOS, lă một pỉasmid đê tâch dòng của vỉ khuẩn Ẹcoli dựa trí n plasmid pRB322, vă có th ể tâi sinh được ở Agrobacterium. TVín vectơ tru n g gian năy chúa; hai nhóm gen chỉ thị - một cho sự chọn lọc d vi khủắn (Km*') vă m ột cho sự săng lọc ở tế băo thực vật (nos-npt-II ), một đoạn tương đồng vối đoạn cố trẽn vectơ pGV385, một đoạn có phổ tâi bản rộng (ColEI) vă đoạn MCS để gân gen cần chuyển (xem hỉnh 6.7).
Sau khi được trộ n lẫn với nhau, giữa hai loại plasmid xảy ra sự tiếp hợp nhờ đoạn khởi đầu EcolEI cd trong pGV1103. Qúa trình tiếp hợp dẫn đến sự hợp n h ấ t giữa bai loại plasmid nhờ hiện tượng trao đổi chĩo xảy ra giữa câc vùng tương đ&ng của hai ỉoại plasm id pGV3850 vă pGV1103. VI thế vectớ liín hợp pGV3850 : : p G V llo ê đđ chứa toăn bộ vectơ tru n g gian trong đtí có gen căn được chuyển văo tế băo thực vật.
Trong hình 6.8 ta ctí thể xem xĩt chi tiết thím về một dạng vectơ tru n g gian 7,5kb có ký hiệu lă pGV922.
Hệ thốnẸ vectơ nhị thể
Khâc với hệ thổng vectơ liín hợp, ở hệ thống vectơ nhị th ế (binaiy vector) đoạn m ang T-ADN vă đoạn m ang g6n vir năm trín hai plasmid khâc nhaụ M ặt khâc, nđ khống n h ât thiết phải chứa đoạn tương d&ng với Ti-plasmid vă cd khả nang tâi bản độc lập trong cả tế băo Ẹcoli vă Agrobacterium. Đẩy cổng lằ ưu đỉểm củả hẻ Ihỗng Vẽctỡ năy 80 với vectơ liín hợp. Dưới đđy ta xem xĩt một hệ thống vecto nhị th ế điến hlnh lă p B in l9 do Bevan thiết k ế từ 1984, nhưng đến nạy vẫn cồn được dùng phổ biến (hinh 6.9).
Doạn ADN c&n chuyến văo tế băo thực vật nẳm kẹp giữa hai tr ậ t tự biín RB vă LB. Ntí gồm 1 gen khảm Pno3-NPT(II)3’ocs vă trậ t tự polylinker được tổng hợp băng con đường hoâ học để gấn. gen căn chuyến. Gen khảm năy được tạo ra bầng câch gấn prom otor nopaline (Pnos) văo đoạn m& hoâ enzym neomycin phosphotransíerase l ĩ thuộc gen Tn5(NPT-II) của vi khuẩn vă ghĩp thím văo đó đoạn kết y của octopine s}mthase (3’ ocs).
Hệ thống vectơ năy được thiết kế tìi hai loại plasmid.
Plasm id th ú n h ất cđ ngu&n gốc từ pU C l9 của vi khuẩn Ẹcoli (vỉ th ế nổ cd th ể tâi sinh tro n g tế băo Ẹcolí) mang đoạn T-ADN chl còn lại hai tr ậ t tự biín RB vă LB ( còn phăn m ang gen gầy khổi u đê bị tâch bỏ) vă xen văo giữa đố lă m ộ t sổ tr ậ t t'ự nucleotit đặc trư n g cho sự nhận biết của enzym giới hạn - dùng để gắn kết gen cần chuyển hoặc câc gen chỉ thị cho sự chọn lọc trong tế băo vi khuẩn hoặc trong tế băo thực vật (như gen N PTII hoặc GƯS).