- Mô phđn sinh chồị Củ
KỸ THUẬT RPLP TRONG NGHIÍN cứu DI TRUYỀN VĂ CHỌN GIỐNG THựC VẬT
7.5.3. Nghiín cứu RFLP trong quần thể dể lập bản dồ
Một khi đả có một quần thể như trín, ADN của từng cả thể sẽ được tâch chiết. Mỗi cđy trong quăn th ể chứa một trậ t tự xâc định câc đoạn nhiễm sắc th ể từ bố mẹ. Dể có được băn đò RFLP cần phải xâc định cho được những đoạn nhiễm sắc thể năo của bố mẹ
có m ật trong mỗi cđy của quần thể đó. Căn nhớ rầng, trậ t tự sắp xếp đó ở câc câ thể F2
hoặc ở th ế hệ thu được sau phĩp lai trở lại sẽ bị thay đổi do sự tâi tổ hợp xảy ra trong quâ trỉn h sinh sản hữu tính diễn ra trước đổ. Cần phải giữ được câc cơ th ể đó ò trạn g thâi sao cho ta cd th ể tâch chiết được một lượng lớn ADN.
• Săng lọc RFLP
Từ trong thư viện câc m ẫu dò, người ta chọn câc mẫu vă thừ với câc dạng bố mẹ để xâc định xem enzym giới hạn năo lă thích hợp để có th ể phât hiện ra tính đa hình RFLP giữa câc dạng bố mẹ đó. Lượng enzym sử dụng tuỳ thuộc văo tính đa dạng cd trong câc cđy bđ mẹ. Chẳng hạn, đối với câc dòng tự phối ở ngô thì chỉ cần dùng 1 hoặc 2 enzym với nhiều mẫu dò để phât hiện tính đa hỉnh, trong khi đđ với lúa thl phải dùng đến 11 enzym với khoảng 75% số mảu dò.
• Chọn cặp chỉ thị / eniym
Trước tiín, phải xâc định cho được câc cặp chỉ thị / enzym thích hợp; tức lă loại enzym cât ADN để tạo ra câc chỉ thị cho phĩp phđn biệt được câc dạng bố mẹ. Bước tiếp theo lă tiến hănh nghiín cứu ở quần th ể lập bản đô, theo câc bước như sau ; tâch chiết ADN từ câc cđy bổ mẹ vă ỉ ừng cđy lai trong quăn th ể lập bản đồ; cât ADN bằng enzym giới hạn; chạy điện di trín gel agarose vă thẵm chuyển lín m ăng lọc để tiến hănh lai ADN. Cần phải cd câc bộ m ăng lai tương ứng cho từ ng enzym; mỗi một bộ m ăng lai chứa
câc phđn đoạn ADN từ mỗi cđy trong quần thể lập bản đồ. Chẳng hạn, bộ thưa nhât có chứa ADN từ mỗi cđy F2 do EcoRI phđn cắt, một bộ khâc sẽ chứa ADN từ mỗi cđy F2 do Pstl ph&n giảị Nếu tính đa hỉnh giữa câc cđy bổ mẹ đă được phât hiện nhò một tổ
hợp chỉ thị /enzym năo đổ, thì nd phải được sử dụng tiếp cho câc lần lập bản (£) sau đó. Ví dụ : Nếu m ẫu dò # 36 được xâc nhận lă cố th ể dùng để phât hiện tính đa
hình giữa câc dạng bố mẹ khi sử dụng Pstl, thỉ sau đd việc lập bản đ& phải sử dụng đến
Pstl. Trong quần th ể lập bản đồ ở F2 chi sử dụng hai loại cđy : 2 kiểu đồng hợp tử (một
trong số đó giống với một trong hai dạng bố mẹ) vă 1 dị hợp tử. Như vậy, khi thử vói thư viện chỉ thị phđn tử (mẫu dò) mỗi cđy trong quần thể dòng lập bản đồ sẽ được xâc nhận lă một cđy dị hợp từ hoặc đồng hợp tử (AA hoặc aa).
• Phđn tích sự liín kẽí
Việc xử lý vă ph&n tich câc sổ liệu thu được để thiết iập một bản đồ di truyền phđn tử phải nhờ đến câc chương trinh mây tính chuyín dụng. Câc chudng trinh phần mềm năy cho phĩp xâc định tần số tâi tổ hợp từ quần thể phđn ly được phđn tích, khả nầng liín kết giữa một chỉ thị cần xâc định với một chỉ thị đê được biết trước vă nhờ vậy có thể xâc định được vỊ trí tuơng đối hay trật tự ph&n bố của câc chỉ thị di truyền ỉiín quan đến câc tỉnh trạng cần nghiín cúu (xem chi tiết ỏ mục 8.3. của chương 8).