- Mô phđn sinh chồị Củ
KỸ THUẬT RPLP TRONG NGHIÍN cứu DI TRUYỀN VĂ CHỌN GIỐNG THựC VẬT
7.2. THƯ VIỆN CHỈ THÍ PHẲN TỬ
Do ÂDN chúa một lượng lớn câc nhóm phosphat tích điện &m ỏ pH trung tính nín nổ sẽ di chuyển về cực dương trong điện trường. Khung phosphodieste của tất cả ĐDN
Phân cAt nhờ enzym giới hạn
r ĩ 0 "
Câc phftn dom ADN
Câc phăn đoạn đugic tâch
ra theo kfch thuớc
Gcl agarosc
đều như nhau nín chúng cd một m ật độ điện tích đồng nlhất. Vỉ thế, nếu đặt ADN văo một mồi trường xốp như agarose hay polyacrylamid thỉ nó sĩ di chuyển sang cực dương (anode) theo ti lệ phụ thuộc văo khối iượng phđn từ. Kỹ th u ậ t năy được dùng để phđn tích câc đoạn ADN cd kích thước khâc nhau được hỉnh thănh sau khi bị enzym giới hạn phđn cât.
Do RFLP của ADN nhđn không thể quan sât tĩọíc tiếp được, nín người ta thường sử dụng những đoạn nhỏ của ADN nhiễm sâc thể lăm những mẫu dò (đdng vai trò như lă câc chỉ thị phđn tử) để phât hiện câc phđn đoạn năo đó. Mẫu dò lă m ột đoạn của ADN hay ARN chứa một trậ t tự bazơ nitơ đậc tĩoing được đânli dấu phóng xạ với hoạt tính rấ t cao dùng để phât hiện câc trậ t tự bazơ nitơ bổ sung tro n g kỹ th u ậ t lai gọi lă "Southern blotting" hay "Nothern blotting”. Do tính đặc hiệu cao của phĩp lai ADN - ADN mă câc mẫu dò có cho phĩp ta phât hiện ra những mảnh riíng lẻ trong hỗn hợp phức tạp câc m ảnh giới hạn khi ADN nhđn bị xử lý bằng enzynị Trong kỹ th u ậ t năy, một bộ câc đoạn nhỏ ADN nhiễm sâc thể đê được chuẩn bị để dùng như những mẫu dò. Một bộ mẫu dò như vậy được gọi lă một thư viện. Sau khi ADN tinh khiết được tâch chiết .vă được xử lý băng enzym giới hạn thì những m ảnh nhỏ (thường có kích thước 2 - 5 kbp) được dùng như những m ẫu dò trong phĩp lai ADN. Tuy nhiín, để cd th ể sử dụng được thì mỗi mẫu dò phải có râ t nhiều phiín bản. Để lăm được điều đó, người ta sử dụng kỹ th u ật tâch dòng gen trong câc tế băo vi khuẩn, như £. coỉị Trong kỹ th u ậ t năy, những mẫu dò được gân văo plasniid của vi khuẩn, sau đđ plasmid lại được biến nạp trở lại văo tế băo vi khuẩn. Trong tế băo vi khuẩn plasmid được sao chĩp vă tống nhanh vỉ số lượng. Nhờ quâ trỉnh nuôi cấy, những vi khuẩn đê được biến nạp sẽ p h ât triển . Tiếp sau đđ, người ta tiến hănh tâch chiết plasmid vă thu được một lượng lớn phiín bản câc mẫu dò, đóng vai trò như eâc chỉ thị phđn tử trong câc phĩp lai ADN.
Sử dụng câc mẫu dò để phât hiện RFLP của ADN nhđn tẽ' băo được tiến hănh bằng câch sau đđy :
ADN nhđn của cđy được tâch chiết vă được xử lý băng niột loại enzym cât giới hạn;
sđU đd được Ghạy điện di trín gẽl apro§§. Kết quẩ lầ, hầnf triệu mảnh được tạo ra vă
được phđn bố trẽn bản gel theo khối lượng phđn tử (hlnh 7.1)
Dể tiến hănh phĩp lai ADN - ADN ĩihằm phât hiện ra câc đoạn đặc trưng, mẫu dò vă câc phđn đoạn ADN trín gel cần phải được thâo xoân để trở thănh câc mạch đơn. Muốn vậy, gel đưạc ngđm trong một dung dịch bazơ, như N aơH , rồi ADN được tâch ra khỏi gel bằng một quâ trình thâm chuyển sang măng lọc nitrơcellulose - được dùng ỉăm măng lai sau năy- với tĩn gọi lă "Southern transfer" (hình 1.2). Do m ăng lọc cd kích thước bằng với tấm gel vă sâu quâ trỉnh tiếp xúc trực tiếp thì ADN th o â t ra khỏi gel vă in lín m ăng lọc, nín kiểĩu phđn bó của câc phđn đoạn ADN trín gel sẽ được giữ nguyín trôn m ăng lọc. ADN đê được thâo xoân gấn rât chặt văo măng lọc. M ăng lọc ở trạ n g thâi như vậy sẽ được dùng tro n g thí nghiệm lai tiếp theọ
Sau khi măng lọc đă được chuẩn bị xong theo phương phâp "Southern transíer" thl nđ cd th ể được lai với câc mẫu dò có trong "thư viện". Về cơ băn, quâ trin h năy bao gồm sự thâo xoắn cho câc m ẫu dò vă cho nố lai với câc phđn đoạn ADN n h đn đă cd trín m ăng laị Trong điều kiện thích hợp về nhiệt độ, nồng độ muốị.. câc m ẫu dò đê được thâo xoân sẽ lai một câch đặic trư n g với câc phđn đoạn của ADN nhđn txín m ăng lai theo nguyín tắc bổ sung. Tuy nhiín, để cd th ể thấy được vị trí lai, chúng phải được đânh dấu theo
132 KỸ THUẬT RFLP TRONG NGHIÍN c ú u DI TRUYỀN
y / măng lai / gd chúta ẤdN
ể.*,bot biển-*..
Ĩ ' ^ f i ' ỉ y > r ĩ
kỷ thuật thâm chuyển Soulhern
phóng xạ tự chụp
H ình 7.2. Kỹ tỉiuậỉ th ê m chuyín Southern tra n s/er vă phóng xạ tự chụp,
Tấm bọi biền đưực lăm ướỉ tăng câch ngđm một phần trong dung dịch đệm thích hợp. Do dung dịch đệm thấm quiì gel vă được hấp Ihụ văo lớp giấy thẩm mềm ở phía trín cùng, mă ADN được lâch khă gel vă gắn văo măng ỉaị
Sau khỉ măng tai được chuần bị xong thì câc mẫu óò RFLP có đânh dấu phóng xạ đirợc laỉ với câc phđn đoạn ADN đẫ dược thấm chuyền sang măng laị; vj trì của câc phên doạn tương dđng vớỉ câc mẫu dò .sề được xâc đinh bằng phương phâp phóng xạ tự chụp. Câc dữ kiện RFLP sẽ được đọc trín fỉim sau khỉ trâng.
m ột câch năo đố. Thường thường, người ta đânh dấu câc mẫu dò bằng Những m ẫu dò thừa được rửa sạch vă m ăng lai được hiện hinh trí n phim đm bản nhờ kỹ th u ật phdng xạ tự chụp (autoradiography) sau thời gian từ văỉ phứt đến nhiều ngăy, đ ể phât hiện câc phđn đoạn đê được lai với câc mẫu dò. Bầng câch như vậy, tù trong một m ẫu ĐDN phức tạp của cđy người ta cổ th ể phât hiện được nhữ ng phđn đoạn riíng biệt. Hiện nay, ngườỉ ta đang chú ý phât triể n kỹ th u ật đânh dấu câc m ẫu dò m ă không cần dùng đến câc chât (fòng vị phđng xạ, như kỹ th u ật dạ quang hoâ học kích hoạt (enhanced chemỉcal luminesence = ECL) để hoạt hoâ phim tro n g thời gian từ ít phút đến văi giờ.