- Mô phđn sinh chồị Củ
3/ Câc tế băo ở pbũi chưa chín vă mô phđn sinh hoạ
mô phđn sinh hoạ
4/ Hạt phấn.
5/ Hợp tử.
Sự phât sinh cơ quan hay phât sinh phối qua pha cailus. Tâi sinh cậy in vitro từ câc dòng tế băo biĩn nạp.
Sự phât triền tỉếp tục của pbđl, chêi hay hca sẽ cho ra niột cđy ktaảm. Hạt pìứia cố nguđn gốc từ câc dòng t£ băo biến nạp được sử dụng chũ việc tạo ra câc hạt cđy đuợc biến nạp nhờ quâ ùnh ưiụ tinh bình thường.
Tạo câc cđy biến nạp trực uếp qua con đường thụ tinh V Ớ I hạt phấn nảy mầm hạy hạt phấn chín đang phât tilỉn mă ADN của nố đầ b| xử lý bềến Ịiíp.
Phât triền trực tlỉp cđy được biến nạp.
6 3 . KHÂI NIỆM CHUNG VỀ CÂC VECTỮ s ử DỤNG TRONG KỸ THUẬT CHUYỂN GEN
Câp vectơ được sử dụng trong biến lịạp di truyỄn của câc t ế băo Eukaryote nổi chung hay của t ế băo thực vật nổi riông đều cổ một sổ dặc điếm chung (hinh 6.1.A). P h ần ỉớn câc vectơ đdu cố chứa câc thănh phân sau; l)_gữn khdỉ động (promotor) thường có nguốn gổc hoặc liốn quan trực tiếp với thực vật, như CaMV-SSS-promotor, 2) m ột đồạn kết thúc (term in ato r), thưỜDg đang được dùng phổ biến 1& noa-terminator hay CaMV-35S- term inator, câc đoạn kết năy phải cd một trậ t tự tín hiộu polyadenin hoâ như lă AATTĐĐ hoặc ĐĐCCAĐ, giúp cho mARN được bền vững hơn; 3) một đoạn chịu trâch nhiệm cho
B GcnkhânB khâng sinh VK Promotor oA aryote ^ V ù n » 3 'c h ử a tín hiệu poầyademnhoâ Gcn cUtlii chọn lọc r r ĐoạnmAhoAgen khâng khâng slidi
vi khuẩn
Hình 6.1. A) Sơ đõ chut^ cho vecta hiển nạp cùa tẽ băo Eukaryotẹ B) Chi tiết ve câc gen chỉ thị dừng dto chọH lọc.
quâ trỉn h tâi băn, có nguồn gốc từ vi khuẩn, như CoỉEl; 4) một đoạn chứa m ột số tr ậ t tự nucleotit đặc trư ng cho sự nhận biết của enzỵm giới hạn MCS (muỉticloning sites); vă 5) câc gen chỉ thị, cho phĩp nhận biết câc tố băo được biốn nạp nhờ câc quâ trìn h chọn lọc ở t ế băo vi khuắn hoặc săng lọc d câc mô tâi sinh. Câc gen năy cổ tính trội vă cổ nguốn gốc từ vi khuẩn, m ă hoạt động của chúng chịu sự kiểm soât của câc prom otor kiểu
Eukaryote, thường lă từ v init khảm thực vật (hỉnh 6.1.B). Người ta thường dùng câc gen chỉ thị kiểm soât tính khâng chất khâng sinh như kanamycin, m ethotrexat hay câc ch ất diệt cỏ, như glyphosat hoặc bialaphos. Để cho việc chọn iọc cổ kết quả thi câc t ế băo được xử lý biến nạp phảỉ m ẫn cảm với câc chất nổi trí n ở nòng độ tương đối thấp. Còn câc gen chỉ thị dùng để săng lọc thường lă những gen của vi khuẩn m ê hoâ cho câc enzỵm dễ p h ât hiện như chloramphenicol acetyl transferase, ^-glucuronidase, luciĩerase, nospalỉn sy n th ase vă octopine sy n th asẹ' Thông thường, người ta hay sử dụng tín h khâng kanam ycin để lăm kiểu hình chỉ thị cho việc chọn lọc vă sự ctí m ặt của ^-glucuronidase để lăm chỉ thị cho sự săng lọc câc tế băo thực vật được biến nạp.
Câc plasm id đê m ang những yếu tố chung như vậy lại có thím những gen chỉ thị đặc biệt cho phĩp xâc định sự biểu hiện của gen cần đựơc chuyển ỏ tế băo thực vật cổ th ế được dùng để chuyển gen trực tiếp văo hệ gen nhđn của thực vật.
Một m ặt khâc, người ta lại thiết kế những kiểu vectơ đặc biệt, trong đó có sử dụng thím m ột ph&n plasm id của vi ỵhnẳn AgrobacỀerium y k thực hiộn quâ trỉnb biến nạp tự nhiôn thống qua hoạt động của loại vi khuẩn năỵ Loại vectơ năy cổ chúc năng chuyển gen vă phổ tâ i bản rộng, cho phĩp tiếp hợp giữa E x o li với Agrobacterium vă duy trỉ được plasm id ở cả hai loại vật chủ đổ.
K.4. CÂC PHUữNG PHÂP CHUYỂN GEN
Hiện nay, cổ n h iỉu tăi liệu đs cập tdi câc phương phâp chuyển gen khâc nhau ở thực vật. Tuy nhiín, ctí thể nẽu ra dưới đđy M n phương phâp chính đa đựơc âp dụng th ăn h công ở m ực vật :
1- Biến nạp giân tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium (Binns, 1990). 2- Biến nạp trực tiếp qua protoplast (Paszkowski, 1989).
3- Biến nạp băng súng bắn gen - gene gun hay biolỉqtics (Sanford,1988). 4- Biến nạp băng vi tiím - microinjection ( Schnorí e t al.,ỉ991 ).
6 .4 .ỉ . C h u y ĩ n g e n n h ờ iAgmbacterium
Văo đầu thố kỷ XX ngưòi ta đê biết đỂa hai loăi vi khuẩn sống trong đSt lă Agrobacterium tumefaciens vă A rhừogenea gđy ra câc bộith kh(fi u hỉnh chđp vă lổng td d phần cổ rS của nhiều cđy hai lâ m&m. v s sau, người ta đ& xâc định được răng, hai ỉoại vi khtiẩn năy chứa hai loại plastnid cổ kích thước Idn lă Tí-plasmỉd , gđy ra kh<fi u (tumour indudng = Tỉ ) vă Ri-plasmid, gđy ra lông tơ (root indudng = R i ). Dđ lă những vectơ od khả năng chuyển một sổ gen của chúng sang tế bỄUỉ thực vật. Quâ trình năy cổ sự tương tâc giữa vi khuẩn vă cđy chủ. TVong nhiều thập ^ qua, những khía cạnh sinh học của hiện tượng năy đa được ns^iín cứu khâ kỹ. I k sẽ đề cập tới nổ ở những phần saụ
• 'Ti-plasmid lă nhđn tế gđy biẽn nạp tự nhiín ở thực vậí
P h ăn lớn câc loại Ti-plasmid cđ kích thước khoảng 200kb vă gòm bốn vùng A, B, c