- Mô phđn sinh chồị Củ
144 KỸ THUẬT PCR VĂ ỨNG DỰNG CỦA NÓ TRONG CHỌNGIỐNG THỰC VẬT
c ớ s ỏ DI TRUYỂN CHỌN GIỐNG THựC VẬT 145 PCK dyng mù ne<» ARNhayADN tổng hợp cADN hêy AON •"V V V V V X / ^ --- gắn đuôi poly((ỉ) /VV*---— primcr thiĩhai ^ ^ pf*^y c d^Dg mỏ neo /WW- — --w <*^;gggc ccccc I Vwfc <--- GGCG cccc ịchu kỳ PCR GGGG <---— cccc --- cccc w ^ GGGG I chu kỳ PCR thiT n -<r--- ccc .V^A--- GGG 2"phấn tử B
PCR giịp cnz>in gidi hạn -X -C z = í-* --- phđn cắt bửí eozym gi<ỉỉ h^n r/ gắn lại primer PCR chu kỳ FCR thứ nhắt 2%hđn tữ //ín/i 8.2.
(A) PCK dạng mỏ neo: trong irường hợp năy chi có một trật tự nucieotỉt lă Ihích họp lăm điềm gắn của primcr, đoỊin ADN đích có thề đưực gắn thím đuôi pc^(G) vă do vậy một đoạn nucleoUt có đuôi poly (C) - gụi lă dạng m ò n a ) - đ ư ự c dùng n h ư prinicr th ứ haị Kỹ thuậl năy đ ư ợ c s ử d ụng đ ề n hđn b ản câc đ ư n vị sao
mê mă trật tự câc axit aniin do nó kiềm soât đê được biết,
(B) PCR n^trợc. PCR có thề được dùng đề nhđn bản một đoạn ADN chưa biếl trật tự nucleotỉl, nhưng đoạn năy Ịạỉ nhm xcn giữa haỉ đoạn khâc có trật tự nucỉeotil đả biết. Câc ỊMlmer sẽ liín kếl vói câc trậl lự đê biết vă
quâ trình kĩt) dăi prỉmer x:’iy ra tha) hai hướng đối lập nhaụ Câc phđn từ ADN vòng chứa đoạn ADN đích được tạo thănh sau Ithi có tâc động của câc enzym cât vă nối lạị
Một điíu cần lưu ý lă, PCR lă một phương phâp phđn tích cực kỳ nhạy, hiệu su ất nhđn bản nd rấ t cao nín phải đảm bảo sự chính xâc vă vệ sinh tro n g thí nghiệm. Trânh để xăy ra trường hợp câc mẫu ADN ở thí nghiệm trước còn dính lại ở câc dụng cụ thí nghiệm gđy nhầm lẫn cho thí nghiệm saụ
Cd nhiều nhđn tố ănh hưởng đến hiệu quă của phươ&g phâp PCR. Có m ột sổ điều sau đđy cần lưu ý : thông thường lượng nucleotit triphosphat đưa văo lă khoảng 200jwM; chiều dăi cửa prìm er rấ t quan trọng ; nín chứa số lượng nucleotỉt > 1 6 , gồm ít n h ât 40% G/C, prim er dăi hơn sẽ có tính đặc hiệu hơn nhưng giâ thănh sẽ đ ắ t hơn; còn nếu m ột prim er chứa một đoạn cổ tới > 4 nucleotỉt liín tục cùng loại thi nổ sẽ m ât tính đặc hiệụ 8.3. Sử DỤNG PCR ĐỂ LẬP BẤN ĐÒ DI TRUYỀN
Bản đồ di truyền lă một sơ đồ gồm những chi thị phđn tử (molecular m arker) hoậc chỉ thị kiểu hình xếp gần nhau, rấ t căn cho sự phđn tích một hệ gen. Câc chỉ thị có liín quan đến câc tính trạ n g cần nghiín cứu được người ta sử dụng trong câc chương trìn h chọn giống thực vật, đặc biệt lă cho câc nghiín cứu chuyển gen vă tâch dòng gen. Bởi vì câc chỉ thị kiểu hình không đủ phong phú để lập một bản đồ di truyền chính xâc nín câc chỉ thị phđn tử đang được sử dụng một câch ngăy căng phổ biến hơn. Câc chỉ thị ADN trước đđy vẫn thường được dùng lă tính đa dạng về chiều dăi câc phđn đoạn cât giới hạn (RFLP). Tuy nhiín, để phât hiện RFLP ta phải âp dụng phĩp lai "Southern blot" rấ t tốn công vă phức tạp. Trong khi đđ, gần đđy ra đời nhiều kỹ th u ật mđi dựa trín nguyín tâc của PCR cho phĩp ta xâc định được câc chỉ thị di tru y ền hoặc tính đa dạng của hệ gen với nhiều ưu điểm hơn như AFLP, SSR, STS, RAPD chẳng hạn kỹ th u ậ t xâc định tín h đa dạng của ADN được nhđn bản ngẫu nhiín, viết tắ t lă RAPD (Random amplifíed polymorphic DNA = RAPD). Nguyín tâc của phương phâp năy lă, người ta sử dụng m ột tập hợp câc prim er cổ tr ậ t tự nucleotit ngẫu nhiín (thường gồm 10 oligonucleotit) để nh&n bản câc đoạn ADN của hệ gen m ột câch ngẫu nhiín theo nguyín tắc PCR vă vì vậy sản phẩm thu được sẽ lă tập hợp đa dạng câc dòng đoạn ADN.
Tính đa dạng thu được nhờ kỹ th u ậ t RAPD lă đâng tin, vi khi ctí sự thay đổi ở m ột bazơ nitơ năo đó thì nó sẽ ngản cản việc tiếp hợp giữa prim er vă đoạn ADN đích. Sự m ất đoạn nhiễm sắc th ể hoặc sự thím bớt điểm gân prim er cũng như sự xen văo m ột gen năo đó sẽ lăm thay đổi kích thước của đoạn ADN đửợc n h đn bản.
Mỗi prim er có th ể tạo ra m ột hoặc m ột văi sự đ a dạng có th ể phât hiện được vă cho ra phổ điện di đặc trư ng như kiểu v&n taỵ Một ưu điểm khâc của phương phâp năy lă cùng với một bộ oligonucleotit ta có th ể sử dụng được với câc loăi khâc nhau, trong khi câc mẫu dò RFLP chỉ có th ể dùng được cho câc loăi ctí quan hệ gần nhaụ Tính đa dạn g thu được từ câc chỉ thị RAPD được đânh giâ lă cao hơn so vđi phương phâp RFLP vă cho phĩp phât hiện được tính đa dạng ngay cả tro n g câc đoạn chứa câc tr ậ t tự nucleotit lặp lạị
ư u điểm sau nữa của phương phâp năy lă sau thời gian nhđn bản khoảng 2- 4 giờ, tính đa dạng có th ể được quan sâ t nhờ kỹ th u ậ t điện di trín gel agarose, trâ n h được sự tổn kĩm về thời gian vă chi phí khi phải thực hiện câc phĩp lai có sử dụng câc m ẫu dò đânh dấu phóng xạ như ở phương phâp RFLP.
Quâ trình xđy dựng m ột bản đô di truyền phđn tử thường trả i qua câc bước sau: • Chọn quần th ể lập bản đb;
- Xâc định tần số tâi tổ hợp xảy ra tro n g quần th ể đó; - Xâc định nhóm liín kết;
- Xâc định vị trí tương đối của gen hoặc chỉ thị phđn tử trín nhiễm sâc thể; 146 KỸ THUẬT PCR VĂ ỨNG DỤNG CỦA NÓ TRONG CHỌN GIỐNG THựC VẬT
- Việc xử lý vă phđn tích câc số liệu th u được để th iết lập một bản đồ di truyền phđn tử phải nhờ đến câc chương trỉn h mây tín h chuyín dụng, như 'lin ka g e-r (Suiter et al., 1983: J. Hered. 74, 203-204; Echt et al., 1992: Maize Genet. Coop, Nwsl. 66, 27-29),
"Mapmarker" (Lander et al., 1986: Cold Spring H arbor Symposia on quantitative biology 51, 9-62; L ander e t al., 1987: Genomics 1, 174-181), 'M apmanager' (Manly and Elliot, 1991: M amm alian Genome 1, 123-126), 'Join M ap' (Stamp, 1993: P lan t J., 3, 739-744). Câc chương trin h phần mềm năy cho phĩp xâc định tần số tâi tổ hợp từ quần th ể phđn ly được phđn tích, khả năng liín kết giữa m ột chl thị cần xâc định với một chỉ thị đă được biết trước vă nhờ vậy có th ể xâc định được vị trí tương đối hay trậ t tự phđn bố của câc chi thị di truyền liín quan đến câc tín h trạ n g cần nghiín cứụ
8.4. NGUYÍN TẮC VĂ c ớ s ỏ DI TRUYẾN CỦA PHƯƠNG PHÂP CHỌN LỌC NHỒ CHÌ TH|
DựA VĂO PCR
Một chỉ thị di truyền cần phải có 2 yíu cầu cơ bản : 1) có sự khâc biệt giữa cơ th ể bố vă cơ th ể mẹ; 2) Nó phải được truyền lại chính xâc cho hậu thế. Người ta phđn ra câc kiểu chỉ thị di truyền sau:
- C hỉ th ị h ìn h thâi: Về m ặt nguyín tâc, m ột tính trạ n g hỉnh thâi Tiăo đtí do một