- Mô phđn sinh chồị Củ
KỸ THUẬT PCR VĂ ÚNG DỤNG CỦA NÓ TRONG CHỌN GlốNG THựC VẬT • • •
TRONG CHỌN GlốNG THựC VẬT• • •
Kỹ th u ậ t phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase Chain Reaction - PCR) do K. B. Mullis phât minh ra năm 1985. Dđy lă phương phâp in vitro để nhđn bản nhanh m ột đoạn ADN năo đd m ă chl cần một khối lượng m ẫu ban đầu hạn chế. Kỹ th u ậ t năy có độ nhạy rấ t cao vă được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như sinh học phđn tử, chẩn đoân, di truyền quần th ể vă phđn tích phâp ỵ
Kỹ th u ật ADN tâi tổ hợp đă tạo ra một bước tiến m ang tính chất câch m ạng đối với di truyền học nhờ việc cho phĩp phđn lập, xâc định câc gen vă đi sđu nghiín cứu chức n ăn g cũng như biểu hiện của gen trong quâ trin h phât triể n hoậc phản ứng của gen đối với câc điều kiện môi trường. Việc âp dụng kỹ th u ậ t PCR cho phĩp ta tiến hănh những nghiín cứu mă trước đđy không cơ khả nêng thực hiện.
Dưới đđy sẽ nđi về m ột số nguyín tắc vă ứng dụng thích hợp của kỹ th u ậ t PCR trong nghiín cứu 4i truyền vă chọn giổng thực vật.
8.1. NGUYÍN TẮC CỦA KỸ THUẬT PCR
Kỹ th u ậ t PCR dựa trín sự xúc tâc của enzym để nhđn bản m ột đoạn ADN nhờ hai đoạn mồi oligonucleotit (primer) tương hợp với hai đầu 3 ’ ờ cả hai mạch của đoạn ADN đích (targ et sequence). Câc oligonucleotit được dùng lăm mồi năy cho phĩp ADN m ẫu được được nhđn bản nhờ sự xúc tâc của ADN - polymerasẹ Dể cho mồi được gắn văo ADN đích, (1) trước tiín hai mạch của chuỗi xoắn kĩp phải được tâch ra nhờ nhiệt độ cao; (2) nhiệt độ phản ứng sau đó được giảm xuống đ ể cho prim er liín kết văo câc m ạch của ADN đích theo nguyín tâc bổ sung; (3) cuối cùng phản ứng polyme hoâ được thực hiện nhờ ADN- polymerase để kĩo dăi mạch bổ sung rạ Đó lă m ột chu kỳ PCR. Do câc sản phẩm mới được tổng hợp ra lại được dùng lăm khuỏn cho m ột prim er khâc, nín sau mỗi chu kỳ số bản sao của ADN đích lại được tă n g lín gấp đôi so với chu kỳ ngay trước đó. Chu kỳ gồm ba giai đoạn như trín được lập lại nhiỉu lần sẽ dẫn đến việc nh đn bản đoạn ADN đích đến hăng triệu phiín bản tro n g văi giờ đồng hô (tương đương với việc tạo ra m ột microgam ADN mẫu tìi 1 picogam ban đầu - 1 picogam = 0,956 X 10’ bp). Phương phâp năy có th ể được âp dụng đối với một phức hợp mẫu như ADN genom vă ctí khả năng nhđn bản m ột gen riíng biệt năo đó. Ngược lại nd cũng cho phĩp nhđn bản những đoạn ĐDN dăi tới lOkb (hinh 8. 1).
Như vậy, bằng câch năy, m ột số lượng khồng hạn chế của một đoạn ADN sẽ được nh ên bản, cho đến khi có th ể phât hiện ra chúng bằng phương phâp điện di trín gel.
co sỏ DI TRUYỀN CHỌN GIỐNG THựC VẬT 143 C'hu kỳ 1
Chu kỳ 2
PTMt
casi
H ìn h 8.1. Sơ đo nhản hăn A D N bằng PCR:
^ tửng n h lẹ l 4* • ^ d in ĩp r Ì iiK T VỈIO P.Cltí1 + . ESii y ADN polymerasc ■ ị- \t’'A/TÌ
săn pham chu ký 1
ỉ<1ng nhicl \/
^ dini primcr Văo
CESS
^ ADN polymcr:ịS€
iraư.i
lEBQ
VCR ki kỹ thuật d ự a ircn sự xúc tâc
của cn/\'m CÌỈ nhđn han một tĩoạn
ADN ctmYc i!i(ýi hạn bời câc đoạn mồi t)lii!onuclcotji (oli^onucỉeoiid p r im e r ị ỉ)t)ạn m ồi sẽ liín kết theo
nguv'ĩn u1c bồ sung v ớ i đ oạn đích ờ dầu y câc niạch đ o n của A D N Siiu khi dă đ ư ợ c tâch ra vă nối dăi Ihco hưcmg 5 “* 3; Mỗi chu kỳ nhđn hăn gồm hii uiai đ ụ in :
(^hu kỳ 1: (I) Chuỗi xDiln kĩp A D N (iuực gfiy biến lính đ ỉ tâch thănh hiií mạch cUrn ờ nhiệt đ ộ 94"C ; (2 ) câc doạn mõi g ồ m khoảng 20 olmonuclcotit licp h ợ p víVi ÙC m ạch dtrn của A D N theo nguyín lắc bồ sung ờ vùng (X ) niìì ta căn nhđn lín, khi nhiệt độ g ủ m ló i 55 - 6 0 “ C; (3) A D N - ptìlym crase chịu nhiệt sử dụng a k primer đ ề bât đ ầ u qu â irình tồng h ự p câc m ạch đcrn bồ sung ờ nhiội độ 72*'C. Mũi tín đ ậm lă a k mạch A D N mtM đ ư ự c lòng h ự p . ở cuui chu kỳ I la â ì hai đ ạ m AĨ3N x u ln kcp chứ a vùng (X ) định nhđn hăn.
(:ỉìu kỳ II . Oui^ Irình gồm ha giiìỉ
đ a m ircn đ ư ợ c lặp ]ạ. T a thấy, lừ bốn mạch d o n A D N Ihì có haỉ m ạch lă nxVi đm.yc tồng hợ p . ở cuối chu kỳ ỉ ỉ đê xuất hiộn bốn đ o ạn A D N kĩp chứa vùng Ọ i).
Chu kỳ như vậy được iặp iại khoảng 10 - 40 lên vă số bản sao của ADN đích dược nhđn lẽn lă 2^** - 2*^® bản.
Gsai
Ban đầu, khi chưa sử dụng loại enzym lầq-polym erase người ta phải thím ADN polymerase trong từ ng chu kỳ n h đn băn; vì ADN polymerase cần cho quâ trìn h tổng hợp ADN khôụg chịu được nhiệt độ lớn hơn 90*^0 ở giai đoạn tâch hai sợi của phđn tử ADN. Sau năy, khi tỉm được loại Tầq - polymerase từ vi khuẩn Thermus aquaticus - loại vi khuẩn sống ở suối nước nóng - một loại enzym chịu nhiệt, thỉ chi cần cho m ột lần Tầq ' polymerase lă đủ. (Trước đđy, người ta dùng loại ADN - polymerase I của vi khuẩn Ẹcoli
- còn gọi lă Klenow enzyme).
D ể cho câc prim er dễ dăng liín kết văo đoạn tương hợp trín ADN đích người ta thường tạo ra m ột số thay đổi ở prim er, ví dụ, gân thím điểm tiếp nhận enzym giới hạn văo đầu 5* của mỗi prim er; hay việc lăm thay đổi vùng xung quanh codon khởi đău cú th ể lăm tăn g hiệu quả dịch m ê ở sinh vật eukaryote được chuyển gen. Việc gắn prom otor (gen khởi động) T7 hoặc m ột prom otor m ạnh tương tự văo prim er cho phĩp tổng hợp ngay ARN từ câc sản phẩm của PCR ( tức lă từ ADN đê được nhđn bản) m ă không cđn phải tâch dòng ADN trong tế băo vi khuẩn.
8.2. SỬ DỤNG PCR ĐỂ TÂCH DÒNG CÂC ĐOẠN ADN CHƯA BIỂT TRẬT T ự NUCLEOTIT CỦA CHÚNG
Để th iết kế câc prim er căn phải biết tr ậ t tự nucleotit ở câc đầu m út của đoạn ADN đích. TSxy nhiín, kỹ th u ậ t PCR củng có th ể được âp dụng để nhđn bản vă phđn tích câc đoạn ADN có tr ậ t tự nucleotit chưa được biết.ví dụ, để phđn lập câc gen thực vật mê hoâ protein kinase, người ta sủ dụng câc thông tin hiện có về trậ t tự của protein kinase từ câc cơ th ể khâc để th iết kế câc prim er cho PCR.
8.2.1. PCR dạng mỏ neo (Anchored PCR)
Trong trường hợp, khi lượng m ẫu protein có đưọc đ ể nghiín cứu quâ ít vă những thông tin về tr ậ t tự axit am in chl có ở m ột vùng năo đđ của protein, thường lă ở đău có nhốm am in, thì sự có m ặt của m ột đuôi homopolyme nằm ă đầu có tr ậ t tự chưa biết của ADN hay C-ADN sẽ thay th ế chơ nhửng thông tiiĩ về tr ậ t tự chưa biết năỵ Một trậ t tự nucleotit tương hỢp với đuôi homopolyme hay còn gọi lă đoạn kiểu mỏ neo (anchor sequence) được dùng như m ột tr ậ t tự mồi (prim ing sequence) cho việc nhđn bản ADN
(xem hình 8.2.A).
8.2.2. PCR ngược (Inverse PCR = IPCR)
Bằng kỹ th u ậ t PCR người ta cđ th ể nhđn bản được cả những đoạn ADN nằm ngoăi prim er. ở đđy, phđn tử ADN được cât ra vă nối lại th ăn h dạng vòng nhò câc enzyni cât giới hạn vă enzym nốị Trong trường hợp năy, ta sử dụng câc prim er mă sự kĩo dăi của chúng xảy ra theo hướng ngược nhau ở hai sợi của ADN; sự kĩo dăi ây sẽ vượt qua ranh giới điểm gân của câc prim er trí n ADN (xem hình 8.2.B). Phương phâp năy rấ t thích hợp cho việc tâch dòng câc đoạn ADN nằm gần chỗ xen văo của một gen nhảy (transposon) gđy ra đột biến. Yíu cầu đ ặ t ra ỏ đđy lă, đipm cât phải không rơi trú n g đoạn xen văo của transposon. T hănh thử, phương phâp IPCR trâ n h được những sự phức tạp khi phải th iết kế m ột thư viện gen cho từ n g kiểu đột biến xảy ra ở gen ta căn nghiín cứụ