V. Tầm quan trọng của táI tổ hợp trong tự nhiên
3. Điều hoà ở mức độ sau phiên mã
Sau khi quá trình phiên mã hoàn tất, các mARN đ−ợc chế biến lại để tạo thành các mARN tr−ởng thành tr−ớc khi ra tế bào chất thực hiện chức năng dịch mã, ở giai đoạn này tồn tại nhiều cơ chế cho phép điều hoà tính chất cũng nh− số l−ợng các mARN sẽ đ−ợc dịch mã.
* Sự suy giảm phiên mã sinh ra các mARN "non": ở vi khuẩn, sự biểu hiện của gen có thể bị ức chế bởi sự kết thúc sớm phiên mã, một hiện t−ợng gọi là suy giảm phiên mã (transcription attenuation). Trong một số tr−ờng hợp, chuỗi ARN mới đ−ợc tổng hợp thông qua một cấu trúc t−ơng tác giữa nó với ARN polymarase để bỏ dở quá trình phiên mã. Khi sản phẩm gen đ−ợc yêu cầu thì phân tử protein điều hoà sẽ liên kết với chuỗi ARN mới sinh ra và ngăn cản quá trình suy giảm, cho phép sự phiên mã hoàn chỉnh phân tử mARN. Sự suy giảm này ở eukaryote có thể đ−ợc điều hoà bởi một số cơ chế khác nhaụ Ví dụ: Khi có sự xâm nhập
protein xoắn vòng xoắn (helix-turn- helix)
dây kéo leucine (leucine zipper)
ngón tay kẽm (zinc finger)
của HIV, ADN của virus đ−ợc tích hợp vào ADN của tế bào vật chủ và đ−ợc phiên mã bởi polymerase IỊ Tuy nhiên enzyme tế bào chủ này th−ờng kết thúc phiên mã sau vài trăm nucleotid và do đó không sinh ra sản phẩm mARN hiệu quả cho toàn bộ hệ gen virus. Khi điều kiện sinh tr−ởng của virus là cực thuận, sự kết thúc phiên mã sớm này có thể bị ức chế bởi protein Tat của virus gắn vào vị trí đặc hiệu Tar trên phân tử ARN, Tat sẽ tập hợp một số protein cho phép ARN pol tiếp tục phiên mã.
* Hiện t−ợng ghép nối các exon: Do cấu trúc của ADN hệ gen Eukaryote có sự xen kẽ
giữa những trình tự mã hoá và không mã hoá, nên sau quá trình phiên mã, mARN cần đ−ợc cắt bỏ những đoạn intron để đảm bảo sự chính xác trong quá trình dịch mã. Thông qua quá trình này có thể tạo ra nhiều loại phân tử mARN, các loại mARN khác nhau thì có cách cắt bỏ intron khác nhaụ Những intron đ−ợc cắt bỏ khác nhau sẽ làm cho gen có khả năng mã hoá cho nhiều hơn một loại protein. ở ng−ời, trung bình mỗi gen mã hoá cho 3 loại protein khác nhau, ở Drosophila, một gen có thể sinh ra 38000 sản phẩm protein khác nhaụ Quá trình cắt bỏ các intron đ−ợc sự điều hoà của 2 cơ chế: D−ơng tính và âm tính.
Hình 6.14: Hai cơ chế chính điều hoà quá trình cắt nốị
Sự xác định giới tính ở Drosophila phụ thuộc vào một chuỗi các cơ chế điều hoà sự cắt nốị Sự xác đinh giới tính sơ cấp ở ruồi giấm là do tỉ lệ giữa bộ NST th−ờng và NST giới tính X, nếu tỉ lệ này là 1/1 (2 NST X và 2 bộ NST th−ờng) sẽ xác định giới cái, còn nếu tỉ lệ này là 1/2 (1 NST X và 2 bộ NST th−ờng sẽ phát triển thành giới đực). Tỉ lệ này đ−ợc xác định trong giai đoạn phát triển phôi sớm và sau đó đ−ợc ghi nhớ qua các thế hệ tế bàọ Sự xác định giới tính ở ruồi giấm đ−ợc điều hoà bởi một chuỗi các sự kiện cắt nối mARN liên quan với 3 gen Sxl, Tra, Dsx. Sự xác định giới tính là con đ−ờng thao tác mà cả hai gen Sxl và Tra đều đ−ợc phiên mã, nh−ng cả hai sản phẩm phiên mã này đều đ−ợc cắt nối và tạo ra các sản phẩm protein không chức năng, và sản phẩm phiên mã của gen Dst cũng trải qua quá trình cắt nối và đến l−ợt nó sẽ ức chế sự biểu hiện của các gen xác định tính cáị Tỉ lệ 1/1 khởi động con đ−ờng phân hoá tính cái trong phôi bởi sự hoạt hoá một promotor trong gen Sxl và gây ra sự tổng hợp một loạt các
sản phẩm phiên mã gen Sxl đặc tr−ng đ−ợc cắt nối để tạo ra phân tử protein Sxl chức năng. Sxl là một protein điều hoà có hai vị trí hoạt động, một gắn với sản phẩm phiên mã của gen Sxl gây ra sự cắt nối đặc tr−ng, tiếp tục tạo ra các sản phẩm protein Sxl chức năng; hai là nó gắn với ARN Tra và sinh ra cắt nối luận phiên của các ARN Tra đ−ợc dịch mã tạo nên protein Tra điều hoà, protein này tác động cùng với Tra-2 tạo ra sự cắt nối đặc tr−ng của mARN Dsx mã hoá cho protein Dsx, hoạt hoá các gen xác định tính cáị
Hình 6.15: Sự điều hoà phát triển giới tính ở ruồi giấm thông qua quá trình cắt nối intron và exon.
* Quá trình gắn mũ và tạo đuôi poly (A): Sản phẩm mARN tr−ởng thành th−ờng đ−ợc
gắn mũ và đuôi poly (A), đây là một quá trình cần thiết cho sự biểu hiện chức năng của mARN. Cấu trúc mũ có vai trò quan trọng trong việc bảo vệ mARN khỏi bị phân huỷ do ADNse tấn công, tăng c−ờng khả năng dịch mã của mARN và vận chuyển mARN từ nhân ra tế bào chất. Tuy ch−a đ−ợc nghiên cứu kỹ, nh−ng các nhà khoa học đ−a ra giả thuyết là sự thay đổi trong vị trí cắt và bổ sung đuôi poly (A) trên bản phiên mã ARN có thể làm biến đổi đầu C của protein, tăng c−ờng hiệu quả ghép nối của các mARN.
* Sự thay đổi ý nghĩa của mARN thông qua mARN editing: Ngay sau khi đ−ợc phiên mã
xong mARN có thể trải qua một quá trình sửa đổi trình tự làm biến đổi ý nghĩa của mARN dạng mARN editing đầu tiên đ−ợc phát hiện trong ti thể của Trypanosome, 1 hay nhiều
nucleotid loại U đ−ợc xen vào mARN ở những vị trí đ−ợc lựa chọn, gây ra những biến đổi trong khung đọc và trình tự ban đầu, từ đó dẫn đến sự thay đổi ý nghĩa trên mARN. Một vài gen phản ứng editing mở rộng trên 50% nucleotid trên phân tử mARN tr−ởng thành là U thêm vàọ Các guide ARNs có đầu 5' bổ sung với một trình tự của mARN editing, và theo sau là trình tự xác định tập hợp nucleotid nào sẽ đ−ợc cài vào bản phiên mã, đến l−ợt nó lại đ−ợc theo sau bởi chuỗi poly (U) ngắn. Cơ chế editing rất phức tạp với U ở đầu 3' của guide ARN đ−ợc chuyển trực tiếp sang bản phiên mã. ở một số loài thực vật cũng có hiện t−ợng editing. Tuy
nhiên, ở đây C chuyển thành U chứ không có sự mất hay thêm nucleotid nào ( tr−ờng hợp này cũng đ−ợc phát hiện ở động vật có vú). Để giải thích vẫn đề này, có giả thuyết cho rằng ti thể chứa hệ thống di truyền cổ x−a không đủ khả năng cho những cơ chế điều khiển khác, và phản ứng editing tạo ra các sản phẩm khác nhau trong điều kiện khác nhaụ Vì thế có thể xem con đ−ờng editing là một di tích của cơ chế hoạt động có hiệu lực trong các tế bào nguyên thuỷ khi hầu hết các ohản ứng xúc tác đ−ợc thực hiện bởi phân tử ARN hơn là bởi protein.
Hình 6.16: Cơ chế ARN editing
ARN editing cũng xuất hiện ở động vật có vú. Một trong những ví dụ điển hình nhất là deamino hoá của adenine thành inosine xảy ra tại một số vị trí đ−ợc lựa chọn trên một số phân tử mARN. Trong một số tr−ờng hợp, sự biến đổi này làm thay đổi kiểu cắt nối của ARN hoặc có thể làm biến đổi ý nghĩa của codon. Phản ứng editing này đ−ợc thực hiện bởi enzyme ADARs (adenosine deaminases acting on ARN).
* Sự vận chuyển mARN ra khỏi nhân: Chỉ 1/20 tổng số ARN ở động vật có vú đã đ−ợc
tổng hợp là đ−ợc rời khỏi nhân đi ra tế bào chất thực hiện chức năng. Số còn lại bị phân huỷ ngay trong nhân d−ới sự tác động của các exosome, là một phức hợp protein lớn có chứa các ARN exonucleasẹ ARN chỉ xuất khẩu khỏi nhân khi quá trình cải biến đã hoàn tất, do đó về nguyên tắc, bất cứ một cơ chế nào ngăn chặn sự hoàn tất của một phân tử mARN đặc tr−ng đều dẫn đến sự cản trở sự xuất khẩu khỏi nhân của mARN. Một ví dụ cho thấy những hiêủ biết rõ nhất về sự điều hoà vận chuyển mARN của nhân xảy ra ở virus HIV. Sau khi sử dụng bộ máy phiên mã của tế bào chủ, phân tử mARN của HIV sẽ đ−ợc cắt nối để tạo ra 30 loại mARN khác nhau, sau đó dịch mã để tạo ra nhiều phân tử protein khác nhaụ Để tạo ra một thế hệ sau hoàn chỉnh, các phân tử ARN không cắt nối phải đ−ợc vận chuyển ra khỏi nhân để đ−ợc bao bọc bởi vỏ capsis. Các ARN ch−a hoàn chỉnh này (có thể bao gồm cả các intron) luôn bị sự cản trở của tế bào vật chủ, chúng v−ợt qua sự cản trở này nhờ sự liên kết của protein Rev (đ−ợc mã hoá từ
hệ gen của HIV) liên kết với trình tự đặc hiệu RRE trong một intron của virus, protein này sẽ t−ơng tác với các thụ quan xuất khẩu khỏi nhân để vận chuyển ARN virus đi qua nhân. điều này liên quan mật thiết đến chu trình tiềm tan và sinh tân của virus HIV khi đã xâm nhập vào tế bào vật chủ.
* Một số phân tử mARN đ−ợc định vị tại những vùng đặc tr−ng trong tế bào chất tr−ớc khi sự dịch mã bắt đầu, nếu mARN đ−ợc định vị tại những vị trí cần protein do no mã hoá thì tế bào sẽ gặp nhiều thuận lợi hơn. Dấu hiệu giúp cho sự định vị đúng vị trí của phân tử mARN là trình tự nằm ở đầu 3' không dịch mã (untranslated region UTR), một vùng mở rộng từ codon kết thúc. Sự xác định vị trí mARN đ−ợc quan sát thấy ở nhiều sinh vật khác nhaụ Nhìn chung, đây là cách mà tế bào sử dụng để tích luỹ nồng độ lớn các phân tử protein đặc tr−ng ở một vị trí phù hợp. Có một số cơ chế định vị đã đ−ợc khám phá, tuy nhiên tất cả các cơ chế đó đều sử dụng dấu hiệu ngay trong phân tử mARN, th−ờng tập trung tại vùng 3' URT.
*Đời sống của mARN:
Hình 6.17 : Cơ chế tác động của hormone tới gen casein
Thời gian sống của mARN cũng là một ph−ơng thức điều hoà ở sinh vật nhân chuẩn, thời gian tồn tại của mARN trong tế bào càng lâu thì càng dịch mã thành nhiều protein. Các mARN eukaryote kém bền do chúng mang các đoạn nucleotid đặc biệt (giàu A và U) kích thích sự phân huỷ mARN. Sự bền vững của mARN có thể thay đổi trong sự đáp ứng với các dấu hiệu ngoại bào, đồng thời phụ thuộc vào nhiều yếu tố: Độ dài của đuôi poly (A) (điều này dẫn đến việc thay đổi độ dài của đuôi poly (A) đ−ợc kiểm soát rất chặt chẽ); khả năng chống chịu với enzyme ribonuclease đ−ợc cân bằng do hoạt tính của hormone (ví dụ điển hình ở gen mã hoá prolactin)
* Cơ chế phân huỷ phân tử mARN trung gian vô nghĩa (nonsense-mediate mRNA decay) đ−ợc sử dụng nh− là hệ thống giám sát mARN sinh vật nhân chuẩn: Đây là cơ chế dùng để loại
bỏ những dạng mARN khác th−ờng xác định tr−ớc khi chúng có hiệu quả dịch mã sang protein. Các phân tử mARN xuất hiện các codon kết thúc sớm trong trình tự sẽ bị phân huỷ rất
nhanh. Các codon két thúc này đ−ợc sinh ra do đột biến hay do kết nối không hoàn chỉnh. Cơ chế nonsense-medicate mRNA decay nhận biết sự sai sót qua mối quan hệ không gian giữa codon kết thúc đầu tiên và ranh giới exon-exon đ−ợc hình thành qua việc cắt nối ARN. Nếu codon kết thúc nằm xuôi dòng 3' đối với tất cả các ranh giới exon-exon, mARN sẽ tránh đ−ợc cơ chế này, còn nếu nh− codon kết thúc nằm ng−ợc dòng 5' đối với bất kỳ ranh giới exon-exon nào thì mARN sẽ bị phân huỷ. Các ribosome dịch mã cùng với các phân tử protein giám sát khác sẽ đánh giá mối quan hệ này của từng mARN. Rõ ràng cơ chế này có ý nghĩa đặc biệt trong tiến hoá, đặc biệt đối với các tế bào có sự tái sắp xếp lại ADN nhiều lần nh− các tế bào hệ thống miễn dịch.
* Sử dụng ARN nhiễu (RNA interference-ARNi): Đây là một cơ chế bảo vệ tế bào bằng
cách phân huỷ các ARN ngoại lai nhờ các ARNị Cơ chế này xuất hiện ở nhiều loại sinh vật, vì thế nó đ−ợc coi là một cơ chế cổ tiến hoá. ở thực vật, cơ chế ARNi giúp tế bào chống lại các virus ARN, ngăn chặn sự tăng sinh của các yếu tố di truyền vận động đ−ợc nhân lên qua trung gian là ARN kép (có thể chỉ tồn tại trong một thời gian ngắn). Sự xuất hiện của ARN kép khởi động cơ chế ARNi bằng cách hấp dẫn phức hợp protein chứa ARN nuclease và ARN helicasẹ Phức hệ này cắt ARN mạch kép, tạo những khe hở (khoảng 23bp) mà vẫn gắn với enzyme, sau đó định h−ớng enzyme đến một phân tử ARN khác có trình tự bổ sung và enzyme sẽ tiếp tục thuỷ phân phân tử nàỵ Các phân tử ARN mới có thể là mạch kép hoặc mạch đơn miễn sao có trình tự bổ sung.