V. Tầm quan trọng của táI tổ hợp trong tự nhiên
5. Điều hoà ở mức độ sau dịch mã
IIỊ CÁC KỸ THUẬT BLOTTING
Mặc dự một dũng cú thểủược xỏc ủịnh và bản ủồ giới hạn của nú ủược thiết lập, thụng tin này tự nú khụng làm sỏng tỏ nhiều về cấu trỳc tinh vi của ủoạn ủược tỏch dũng và của gen mà nú mang. Cuối cựng, mục tiờu là phải nhận ủược trỡnh tự gen, tuy nhiờn sẽ là khụng nhạy cảm nếu bắt ủầu bằng việc giải trỡnh tự ngay lập tức. Chẳng hạn, ta cú một ủoạn 20kb của ADN hệ gen ủó ủược tỏch dũng trong một vector thay thế λ, và gen ta quan tõm chỉ cú chiều dài 2kb, khi ủú nếu giải trỡnh tự ngay lập tức sẽ lóng phớ. Vỡ vậy trong nhiều thớ nghiệm, ủiều thiết yếu là phải xỏc ủịnh ủược phần nào của dũng ban ủầu cú chứa cỏc vựng quan tõm. Cú thể thực hiện ủiều này bằng cỏc phương phỏp dựa trờn việc thẩm tớch (blot) cỏc phõn tử axit nucleic lờn màng và lai với mẫu dũ ủặc hiệụ Về một phương diện nào ủú, ủõy là sự mở rộng quỏ trỡnh xỏc ủịnh ủặc trưng của dũng bằng cỏch lai khuẩn lạc hoặc vết tan và ta sẽ nhận ủược những thụng tin chi tiết hơn về cấu trỳc của dũng.
Hỡnh 7.2: Kỹ thuật Southern blotting
Kỹ thuật blot ủầu tiờn ủược Ed Southern hoàn thiện, vỡ vậy gọi là Southern blotting. Trong phương phỏp này cỏc ủoạn ADN sinh ra do xử lý enzyme giới hạn ủược ủiện di trờn gel agarosẹ Sau ủú cỏc ủoạn ủó tỏch biệt ủược chuyển lờn Nitrocellulose hoặc màng nylon bằng kỹ thuật blot. Phương phỏp blot ủầu tiờn là blot mao dẫn, sau ủú phương phỏp blot chõn khụng và blot ủiện ủó ủược hoàn thiện, nhưng phương phỏp blot mao dẫn ban ủầu vẫn ủược sử dụng rất hiệu quả và phổ biến. Khi cỏc ủoạn ủó ủược chuyển lờn từ gel và bỏm vào màng lọc thỡ nú trở thành bản sao của gel. Sau ủú màng lọc cú thể ủược lai với mẫu dũ phúng xạ theo cỏch tương tự như với những màng lọc khuẩn lạc và vết tan. Với tất cả cỏc phộp lai, ủiều mấu chốt là phải cú mẫu dũ thớch hợp. Sau khi lai và rửa, màng lọc ủược ỏp lờn phim X quang và tạo ra bản phúng xạủồ, bản này cung cấp thụng tin về cấu trỳc của dũng.
Phương phỏp này cũng cú thể ỏp dụng cho ARN, nhưng ngược với ADN, trong trường hợp này nú cú tờn là Northern blotting. Phương phỏp này rất hữu hiệu trong việc xỏc ủịnh hỡnh mẫu lai ủối với cỏc mẫu mARN, và cú thể xỏc ủịnh xem cỏc vựng nào của ủoạn ADN tỏch dũng cú thể lai với một mARN cụ thể. Tuy nhiờn nú thường ủược sử dụng nhiều hơn như phương phỏp ủo mức ủộ của sản phẩm phiờn mó trong quỏ trỡnh biểu hiện của một gen cụ thể.
Cú hai biến thỏi nữa của kỹ thuật blot. Nếu cỏc mẫu axit nucleic khụng ủưa vào ủiện di mà quết thành vết trờn màng lọc thỡ quỏ trỡnh lai ủược thực hiện như Northern và Southern blot, kỹ thuật này cú tờn gọi là dot-blot, ủặc biệt hữu ớch trong việc thu nhận số liệu ủịnh lượng trong nghiờn cứu sự biểu hiện gen. Một kỹ thuật nữa là Western blotting, bao gồm việc chuyển cỏc phõn tử protein ủó phõn tỏch bằng ủiện di lờn cỏc màng. Sau ủú màng này ủược xử lý khỏng thểủể phỏt hiện protein quan tõm với cỏch tương tự như sàng lọc miễn dịch ủối với cỏc vết tan ủược chuyển từ cỏc thư viện biểu hiện.