Việc xỏc ủịnh trỡnh tự ADN cung cấp những thụng tin hết sức hữu hiệu về cỏc trỡnh tự mang mó di truyền, về cỏc vựng kiểm soỏt và về cỏc ủặc tớnh khỏc như cỏc trỡnh tự can thiệp (intervening) chẳng hạn. Như vậy việc xỏc ủịnh ủầy ủủ cỏc ủặc trưng của gen nhất thiết phải bao gồm việc xỏc ủịnh trỡnh tự, và một chiến lược thớch hợp phải ủược hoạch ủịnh ủể cú thể ủạt tới ủớch một cỏch hiệu quả nhất, tớnh phức tạp của chiến lược xỏc ủịnh trỡnh tự tuỳ thuộc vào hàng loạt cỏc nhõn tố, chủ yếu tuỳ thuộc vào chiều dài của ủoạn cần xỏc ủịnh trỡnh tự. Phần lớn cỏc phương phỏp giải trỡnh tự cho phộp ủọc ủược 300-400 bazơ trờn một bản gel.
Về cơ bản cú hai cỏch giải quyết cỏc dự ỏn giải trỡnh tự lớn. Hoặc dựng kỹ thuật ngẫu nhiờn hay “Shotgun”, hoặc triển khai một chiến lược tuần tự cú tổ chức mà ởủú vị trớ của mỗi ủoạn ủó ủược biết trước khi giải trỡnh tự. Trong phương phỏp Shotgun, cỏc ủoạn ngẫu nhiờn ủược sinh ra và ủược giải trỡnh tự. Sự lắp rỏp trỡnh tự hoàn chỉnh dựa trờn sự gối lờn nhau ủầy ủủ của cỏc ủoạn ủược giải trỡnh tự ủể cho mỏy tớnh cú thể sắp xếp trỡnh tự chớnh xỏc từ cỏc số liệu thụ. Chiến lược giải trỡnh tự tuần tự thường hiệu quả hơn cỏch dựng cỏc ủoạn ngẫu nhiờn. Nờn giải trỡnh tự hai sợi của ADN một cỏch ủộc lập sao cho bất kỳ sự bất thường nào ủều cú thể phỏt hiện và giải trỡnh tự lại ủể kiểm tra, nếu thấy cần thiết, sau ủú trỡnh tự ủầy ủủ sẽủược mỏy tớnh lắp rỏp. Sẽ dễ sàng hơn nếu cỏc ủoạn gối nhau ủược phõn lập ủể tỏch dũng thứ cấp, vỡ cỏc vựng gối nhau tạo ủiều kiện cho cỏc ủoạn kế tiếp nhau ủược nhận dạng một cỏch dễ dàng.
IV.1. Phương phỏp xỏc ủịnh trỡnh tự Maxam-Gilbert (phương phỏp hoỏ học)
Đũi hỏi phải cú một ủoạn ADN xỏc ủịnh ủể làm vật liệu khởi ủầụ Đoạn này khụng cần thiết phải tỏch dũng trong một vector plasmid, như vậy kỹ thuật cú thể ỏp dụng cho bất kỳ một ủoạn ADN nàọ ADN ủược ủỏnh dấu phúng xạ32
P tại ủầu 5’ của mỗi sợi và cỏc sợi ủược biến tớnh, tỏch nhau ra và ủược tinh sạch ủể cho một tập hợp cỏc sợi ủược ủỏnh dấu dựng cho cỏc phản ứng xỏc ủịnh trỡnh tự. Bước tiếp theo là sửa ủổi hoỏ học ủối với cỏc bazơ trờn sợi ADN. Việc này ủược thực hiện trong một loạt gồm bốn hoặc năm phản ứng với tớnh ủặc hiệu khỏc nhau, và cỏc ủiều kiện phản ứng ủược lựa chọn sao cho, tớnh trung bỡnh, chỉ một sửa ủổi diễn ra trong mỗi bản sao của phõn tử ADN. Sau ủú, cỏc bazơ bị sửa ủổi ủược loại khỏi nhúm ủường của chỳng và cỏc sợi bị cắt tại cỏc vị trớ này bằng piperidin. Nguyờn lớ ởủõy là một số lượng lớn cỏc phõn tử trong cỏc phản ứng khỏc nhau sẽ tạo ra cỏc ủoạn cú một ủầu kết thỳc tại cỏc bazơ khỏc nhau và cú chiều dài chỉ khỏc nhau một nucleotidẹ Người ta gọi ủú là cỏc ủoạn xếp (nested fragment).
Hỡnh 7.3: Xỏc ủịnh trỡnh tự ADN bằng phương phỏp Maxam-Gilbert, Phương phỏp xỏc ủịnh trỡnh tự Sanger-Coulson (phương phỏp enzyme hay dideoxy)
IV.2. Phương phỏp xỏc ủịnh trỡnh tự Sanger-Coulson (phương phỏp enzyme hay dideoxy)
Mặc dự kết quả cuối cựng cũng tương tự như trong phương phỏp hoỏ học, kỹ thuật Sanger-Coulson hoàn toàn khỏc với kỹ thuật Maxam-Gilbert. Trong trường hợp này bản sao của ADN cần xỏc ủịnh trỡnh tự ủược tạo ra bởi ủoạn Klenow của ADN polymerasẹ Khuụn dựng cho phản ứng này là ADN sợi ủơn, và ủoạn mồi cần ủược dựng ủể cung cấp ủầu 3’ cho ADN polymerase nhằm bắt ủầu tổng hợp bản saọ Việc sản xuất cỏc ủoạn xếp ủược thực hiện bằng cỏch xen dNTP trong mỗi phản ứng. Cỏc dNTP này thiếu nhúm hydroxyl tại vị trớ 3’ của deoxyribose (gọi là đNTP), nhúm này cần thiết cho quỏ trỡnh kộo dài chuỗi khi tổng hợp ADN. Bốn đNTP (A, C, G, T) ủược ủưa vào cả bốn phản ứng và mỗi phản ứng ủều diễn ra với 4 dNTP bỡnh thường. Nồng ủộ cỏc dNTP phải ở mức mà chỳng khụng ủớnh vào chuỗi ADN ủang tổng hợp một cỏch liờn tục. Do vậy mỗi phản ứng tạo ra hàng loạt cỏc ủoạn kết thỳc tại một nucleotid ủặc thự, và 4 phản ứng gộp lại sẽ cung cấp một bộ cỏc ủoạn xếp. Chuỗi ADN ủược ủỏnh dấu bằng cỏch gắn một dNTP phúng xạ trong hỗn hợp phản ứng. Đú thường là [α- 35
S]dATP, nú cho phộp ủọc ủược một ủoạn trỡnh tự dài hơn từ mỗi gel riờng biệt so với ủỏnh dấu bằng 32P như vẫn dựng trước ủõỵ
Việc tạo ra cỏc ủoạn ủể xỏc ủịnh trỡnh tự theo kiểu này thường phức tạp hơn kiểu xỏc ủịnh trỡnh tự hoỏ học, và nhiều khi phải dựng ủến cả kỹ thuật tỏch dũng thứ cấp vào cỏc vector khỏc nhau, cú phương phỏp cần tỏch dũng ADN vào phage M13 ủể tạo ra ADN sợi ủơn trong quỏ trỡnh xõm nhiễm. Việc ủú cung cấp cơ chất thớch hợp cho cỏc phản ứng xỏc ủịnh trỡnh tự.
IV.3. Điện di và ủọc trỡnh tự
Cỏc ủoạn ADN ủược sinh ra trong cỏc phản ứng xỏc ủịnh trỡnh tự, ủược tỏch nhau ra bằng ủiện di trờn gel polyacrilamid. Cỏc gel này thường chứa 6-20% polyacrilamid và 7M ure, cú tỏc dụng như là một nhõn tố biến tớnh làm giảm hiệu quả hỡnh thành cấu trỳc bậc hai của
ADN. Điều ủú là quan trọng vỡ cỏc ủoạn cú chiều dài chỉ khỏc nhau một nucleotid ủược tỏch nhau ra trờn gel. Cỏc gel mũng (<0.5mm) ủược ủặt trong một hiệu ủiện thế cao cú thể nung núng chỳng lờn tới 60-700C nhằm duy trỡ cỏc ủiều kiện biến tớnh.
Hỡnh 7.4: Đọc trỡnh tự ADN
Khi gel ủó chạy xong, nú ủược tỏch ra khỏi mỏy và ủược sấy khụ trờn giấy, sau ủú ỏp vào phim chạy phúng xạ, sự phỏt xạ của mẫu ủỏnh dấu sẽ hoạt hoỏ cỏc hạt bạc trờn phim, làm cho chỳng biến thành màu ủen khi trỏng rửa phim. kết tủa là tạo ra biểu ủồ phúng xạ tự ghi, biểu ủồ này ủược ủọc từ dưới lờn trờn, từủoạn nhỏ nhất về phớa trờn. Trong phương phỏp này, trỡnh tự của hàng trăm bazơ cú thểủược xỏc ủịnh trờn một gel riờng biệt. Sau ủú cỏc thụng số về trỡnh tựủược so sỏnh và xem xột bằng mỏy vi tớnh, mỏy này cú thể thực hiện những phộp phõn tớch như dịch sang trỡnh tự cỏc axit amin, xỏc ủịnh cỏc ủiểm cắt của enzyme giới hạn, cỏc ủoạn tương ủồng và cỏc cấu trỳc khỏc như khởi ủiểm (promoter) và cỏc ủoạn cú chức năng ủiều khiển.