V. KỸ THUẬT NHÂN AND ĐẶC HIỆU
b. Cỏc vector phage
* Cỏc tớnh chất cơ bản của phage
Phage (hay cũn gọi là thực khuẩn thể) là virus xõm nhiễm và làm phõn giải vi khuẩn. Phage cú kớch thước nhỏ nờn cũn ủược gọi là hạt.
Về mặt cấu trỳc, phage ủược chia thành 3 nhúm chớnh: khụng ủuụi, cú ủầu và ủuụi, cú lụng. Vật chất di truyền cú thể là ADN mạch ủơn, kộp, hoặc ARN. Ở cỏc phage khụng ủuụi và cú ủuụi, hệ gen ủược bao bọc trong vỏ protein gọi là capsid.
Cỏc phage cú thể phõn thành phage ủộc (virulent) và phage ụn hoà (temperate) tuỳ thuộc vào chu trỡnh sống của chỳng. Khi một phage chui vào trong một tế bào vi khuẩn, nú cú thể sinh ra nhiều phage và giết chết tế bào ủú, ủú là chu trỡnh sinh tan (lytic) hoặc cú thể xõm nhập vào nhiễm sắc thể và ở lại ủú mà khụng giết chết tế bào, ủú là chu trỡnh tiềm tan (lysogenic). Phage ủộc là phage chỉ cú chu trỡnh sinh tan, phage ụn hoà là phage cú chu trỡnh tiềm tan, nhưng cũng cú thể phảứng sinh tan trong những ủiều kiện thớch hợp.
Việc sử dụng phage làm vector cú nhiều ưu ủiểm hơn so với cỏc vector plasmid:
+ Phage ủược trang bị một hệ thống xõm nhập vào tế bào vi khuẩn và cú khả năng sinh sụi rất nhanh, hiệu quả xõm nhiễm này cao hơn nhiều so với việc chuyển plasmid vào vi khuẩn.
+ Kớch thước ủoạn ADN mà vector cú thể tiếp nhận lớn hơn rất nhiều so với plasmid. Tuy nhiờn, việc sử dụng phage cú ủiểm bất lợi là thao tỏc phức tạp hơn.
* Cỏc nhúm phage thường sử dụng làm vector tỏch dũng trong cụng nghệ di truyền
Phần lớn cỏc phage ủược sử dụng làm vector hiện nay bắt nguồn từ phage λ thuộc thế hệ phage thứ nhất. ADN của phage λ cú chiều dài 48502bp, nằm trong phần ủầu của phagẹ
Cỏc phage thuộc thế hệ thứ hai rất ủa dạng, mỗi loại thớch ứng với một mục tiờu sử dụng:
+ Cỏc phage EMBL 3 và 4, bắt nguồn từ phage λ với một ủiểm khỏc biệt. mỗi polylinker ủược thờm vào hai bờn trỡnh tự ADN trung tõm, trỡnh tự này sẽủược loại bỏủể thay bằng ủoạn ADN cần gắn vàọ Cỏc phage này cú thể tiếp nhận những ủoạn 15-20kb và là vector thớch hợp nhất cho việc thiết lập thư viện bộ gen.
+ Cỏc phage λGEM 11 và 12 là cỏc dạng cải tiến của phage EMBL; ngoài vựng polylinker, chỳng cũn mang cỏc promotor ủặc trưng cho ARN polymerasẹ Điều này cho phộp
tổng hợp một số lượng lớn ARN, ủặc biệt là cỏc mẫu dũ ARN và dựng chỳng ủể rà tỡm cỏc ủoạn ADN lõn cận trong thư viện gen.
+ Cỏc phage λgt 11 và 18-23 cũng bắt nguồn từ phage λ với một ủặc trưng tiờu biểu: ủú là cỏc vector biểu hiện. Cỏc phage này cú mang một phần gen lacZ mó húa cho enzyme β- galactosidasẹ Cỏc phage này ủược dựng khi người ta cú một khỏng thểủặc trưng cho protein mó húa bởi trỡnh tự ADN cần tỡm và muốn dựng nú ủể phỏt hiện vector tỏi tổ hợp trong thư viện gen.
Phage M13: Là một phage thể sợi, xõm nhiễm ủặc trưng Ẹ coli. Phage M13 là một phage mạch ủơn, cú kớch thước 6.4kb, trong tự nhiờn chỉ xõm nhiễm cỏc vi khuẩn giống ủực cú mang một cấu trỳc ủặc biệt gọi là lụng gai giới tớnh (F-pili). Chớnh sự tương tỏc giữa cấu trỳc này với lớp vỏ ngoài của phage giỳp phage xõm nhập vào tế bào chủ. Người ta cú thể dựng phương phỏp biến nạp ủể chuyển phage vào trong tế bào vi khuẩn nhưủối với plasmid nhưng hiệu quả rất thấp. Ưu ủiểm của loại vector này là tạo ủược một số lượng lớn phõn tử ADN chỉ mang trỡnh tự của một mạch.