V. KỸ THUẬT NHÂN AND ĐẶC HIỆU
V.5. Xỏc ủịnh chế ủộ nhiệt thớch hợp
Trong mỗi chu kỳ phản ứng PCR, hỗn hợp phản ứng ủược luõn chuyển giữa 3 nhiệt ủộ: + Nhiệt ủộ biến tớnh: Thường là 940C.
+ Nhiệt ủộ gắn mồi: Tuỳ thuộc vào chiều dài và thành phần nucleotid trong ủoạn mồi ủược sử dụng. Là nhiệt ủộủểủoạn mồi gắn vào khuụn.
Nhiệt ủộ kộo dài: khoảng 72oC, là mức tối ưu của taq polymerasẹ
Sự bắt cặp ADN-ADN là một hiện tượng phụ thuộc vào nhiệt ủộ, nếu nhiệt ủộ quỏ cao thỡ khụng cú sự bắt cặp xảy ra, cỏc ủoạn mồi và ủoạn sợi khuụn sẽ tỏch nhau ra, nếu nhiệt ủộ quỏ thấp thỡ cỏc thể lai khụng tương xứng rất bền vững-trong ủú cú nhiều cặp bazơ khụng bổ trợ cho nhaụ
Nhiệt ủộ này ủược tớnh toỏn bằng cỏch xỏc ủịnh nhiệt ủộ núng chảy (Tm) của cặp lai khuụn-ủoạn mồị Tm là nhiệt ủộ mà ởủú cỏc thể lai cặp bazơ bổ trợ tỏch nhau ra, và một nhiệt ủộ thấp hơn Tm chừng 1-2 ủộ là ủủ ủể cho phộp thể lai khuụn-ủoạn mồi bổ trợ xảy ra, nhưng lại quỏ cao ủể hỡnh thành một ủoạn lai với một cặp bazơ khập khiễng bền vững.
Tm cú thể ủược xỏc ủịnh qua thớ nghiệm nhưng nú thường ủược tớnh bằng cụng thức ủơn giản sau ủõy:
Trỡnh tựủoạn mồi 5’-AGACTCAGAGAGAACCC-3’ 4G, 5C, 7A, 1T
Tm = (4x9) + (2x8) = 52oC.
***Chỳ ý: Cần phải thiết kếủoạn mồi sao cho chỳng cú cựng một nhiệt ủộ gắn mồi Tm. Tm = [4x(G+C) + 2x(A+T)]
VỊ ĐIỆN DI TRấN GEL
Kỹ thuật ủiện di trờn gel là hết sức quan trọng trong kỹ thuật di truyền vỡ nú là cỏch chủ yếu làm cho cỏc ủoạn axit nucleic hiển thị trực tiếp. phương phỏp này dựa trờn một ủặc tớnh của axit nucleic là ở nhúm phosphodiester trung tớnh chỳng mang ủiện tớch õm nhờ cỏc nhúm phosphate nằm trờn khung phosphodiester của cỏc sợi axit nucleic. Điều ủú cú nghĩa là cỏc phõn tử sẽ chạy về cực dương khi ủặt chỳng vào ủiện trường. Kỹ thuật này ủược tiến hành trờn một ủệm gel cú tỏc dụng phõn tỏch cỏc phõn tưaxit nucleic theo kớch thước.
Kiểu loại gel dựng trong ủiện di cú tỏc dụng rất quan trọng ủối với mức ủộ phõn tỏch cỏc phõn tử, nú phụ thuộc vào cấu trỳc và kớch cỡ của cỏc lỗ cú trong gel. Cú hai loại gel ủược sử dụng phổ biến là gel agarose và polyacrilamid. Gel agarose thường dựng trong mỏy ủiện di ngang và gel polyacrilamid thường dựng trong mỏy ủiện di ủứng. Gel polyacrilamid thường ủược dựng ủể phõn tỏch cỏc phõn tử axit nucleic cú kớch thước nhỏ trong cỏc ứng dụng như xỏc ủịnh trỡnh tự ADN vỡ kớch thước lỗ nhỏ hơn trong agarosẹ
Điện di ủược thực hiện bằng cỏch ủưa cỏc mẫu axit nucleic vào gel và ủặt một ủiện ỏp vào ủú. Trạng thỏi này ủược duy trỡ cho ủến khi chất nhuộm màu ủỏnh dấu (thường là xanh bromphenol bổ sung vào mẫu trước khi ủưa vào gel) chạy tới ủầu cuối của gel. Cỏc axit nucleic trờn gel thường hiển thị khi nhuộm bằng ethidium bromide và ủược soi dưới ỏnh sỏng tử ngoạị Cỏc axit nucleic hiện lờn ở dạng cỏc băng màu da cam, cú thể chụp ảnh và ghi nhận lạị Cũng cú thể dựng gel polyacrylamid và nhuộm bằng phương phỏp nhuộm bạc, khi ủú cỏc băng sẽ cú màu tớm ủỏ dưới ỏnh sang ban ngày bỡnh thường. Cỏc sốủo cú thểủược sử dụng ủể ủỏnh gia kớch thước của cỏc ủoạn chưa biết bằng cỏch so với một thang chuẩn mà kớch thước ủó biết. Điều này ủặc biệt hữu ớch trong kỹ thuật lập bản ủồ giới hạn.
Hỡnh 7.7: Đệm gel hiển thị sự phõn tỏch cỏc ủoạn ADN ủược cắt bởi cỏc loại RE
Ngoài việc sử dụng ủể phõn tớch cỏc axit nucleic, ủiện di trờn gel polyacrylamid cũn ủược sử dụng rộng rói ủể phõn tớch cỏc protein với những nguyờn lớ cơ bản là tương tự giống nhaụ
CÂU HỎI ễN TẬP CHƯƠNG 7
1. Bản ủồủiểm giới hạn là gỡ? Phương phỏp thiết lập bản ủồ cỏc ủiểm giới hạn. Cho vớ dụ minh họa và vai trũ ứng dụng của bản ủồ cỏc ủiểm giới hạn.
2. So sỏnh những ủiểm giống và khỏc nhau cơ bản giữa thư viện AND và thư viện cADN
3. Ky thuật blotting gồm những hỡnh thức nàỏ Giữa cỏc hỡnh thức này cú ủiểm gỡ khỏc nhau cơ bản? Hóy mụ tả con ủường Southern blot.
4. Hóy trỡnh bày cỏc phương phỏp giải trỡnh tự AND.
5. Hóy phõn tớch cỏc ủiều kiện của phản ứng nhõn AND ủặc hiệu và con ủường thực hiện nú.