V. Tầm quan trọng của táI tổ hợp trong tự nhiên
5. Điều hoà ở mức độ sau dịch mã
IỊ THƯ VIỆN GEN
IỊ1. Thư viện ADN hệ gen (genomic library)
Tỏch dũng ADN bằng bất cứ cỏch nào ủều sẽ cho ra cỏc phõn tử ADN tỏi tổ hợp, thường nằm trong cỏc vector plasmid hay trong vector phage, ủược duy trỡ trong cỏc tế bào vi khuẩn hoặc trong cỏc hạt phagẹ Tập hợp cỏc dũng ủộc lập như thế gọi là thư viện hay ngõn hàng dũng. Thuật ngữ thư viện hệ gen thường ủược dựng ủể mụ tả một bộ cỏc dũng ủại diện cho toàn bộ hệ gen của một sinh vật, và việc tạo ra một thư viện như thế thường là bước ủầu tiờn trong việc phõn lập một trỡnh tự ADN từ hệ gen của một sinh vật.
Một thư viện hệ gen tốt cú những ủặc trưng sau:
+ Phải ủại diện cho toàn bộ hệ gen của một sinh vật, tựa như một bộ cỏc ủoạn tỏch dũng mang những phần trựng lặp (overlapping), ủược tạo ra một cỏch ngẫu nhiờn và ủược duy trỡ ở dạng bền vững khụng cú ủoạn nhầm lẫn nàọ
+ Kớch thước của hệ gen (số lượng cỏc dũng cần thiết): Hệ gen nhỏ như Ẹcoli sẽ ủũi hỏi ớt dũng hơn nhiều so với hệ gen lớn và phức tạp như hệ gen ngườị Loại vector ủịnh sử dụng cũng quyết ủịnh kớch thước của ủoạn cần tỏch dũng. Tuỳ thuộc vào kớch thước của hệ gen mà lựa chọn những vector thớch hợp.
Để thiết lập một thư viện hệ gen, trước hết cần phải tỏch chiết ADN hệ gen của sinh vật ủú, cắt ADN thành từng ủoạn cú kớch thước xỏc ủịnh bằng enzyme cắt giới hạn, rồi gắn cỏc ủoạn này vào vector ủể tạo vector tỏi tổ hợp. Cỏc vector tỏi tổ hợp sau ủú ủược ủưa vào tế bào chủ, cỏc tế bào chủ sẽủược nuụi cấy trờn mụi trường ủặc và hỡnh thành nờn cỏc dũng (clone).
+ Khi chuẩn bị cỏc ủoạn ADN ủể tỏch dũng, cần lưu ý ủến trọng lượng phõn tử của ADN sau khi tỏch chiết từ sinh vật và phương phỏp ủể phõn ủoạn ADN. Đối với một thư viện hoàn toàn ngẫu nhiờn (nghĩa là khụng phụ thuộc vào trỡnh tự) thỡ nờn tỏch chiết ADN cú ủộ dài vượt quỏ 100kb, sau ủú chọn lọc kớch thước nhằm tỏch ủược cỏc ủoạn nằm trong phạm vi cỏc
kớch thước mong muốn. Cú thể phõn ủoạn bằng bẻ góy cơ học hoặc bằng cỏch xử lý enzyme giới hạn từng phần.
+ Sau khi thiết lập ủược cỏc ủiều kiện tối ưu ủể phõn giải từng phần bằng enzyme giới hạn thỡ cú thể chuẩn bị mẫu ADN ủể tỏch dũng. Sau khi xử lý, mẫu sẽủược phõn ủoạn bằng ly tõm trong gradient nồng ủộ hoặc bằng ủiện di, sau ủú cỏc ủoạn trong khoảng 17-23kb ủược chọn lọc ủể nốị Khi tiến hành quỏ trỡnh nối thỡ cỏc phõn tử ADN tỏi tổ hợp chuỗi khảm ủược tạo ra, ủõy là giai ủoạn sản sinh ra thư viện sơ cấp bao gồm những hạt phage tỏi tổ hợp riờng biệt. Sau ủú ủược sàng lọc, loại bỏ những phần khụng cần thiết. Nếu ủoạn trỡnh tự ta quan tõm khụng phõn lập ủược thỡ phải tạo ra và bọc gúi nhiều ADN tỏi tổ hợp hơn nữa, trong trường hợp này cần phải nhõn thư viện lờn, bằng cỏch cấy phage ủó bọc gúi lờn nũi Ẹcoli chủ thớch hợp, sau ủú tạo dịch huyền phự từ cỏc vết tan bằng cỏch dựng một dung dịch ủệm rửa nhẹ cỏc ủĩa cấỵ Dịch huyền phự phage nhận ủược cú thể lưu giữ lõu dài và nú sẽ cung cấp ủủ vật liệu cho cỏc thớ nghiệm sàng lọc và phõn lập tiếp theọ Mặc dự việc nhõn lờn là một bước hữu ớch trong quỏ trỡnh tạo ra cỏc thư viện bền vững, nhưng nú cú thể làm sai lệch thư viờn. Một số phage tỏi tổ hợp cú thể bị mất ủi, do sự cú mặt của cỏc trỡnh tự lặp lại trong ủoạn xen, chỳng cú thể làm mất ổn ủịnh về phương diện tỏi tổ hợp. Một số phage cú thể biểu hiện cỏc ủặc tớnh sinh trưởng biệt hoỏ làm cho tớnh ủại diện hoặc quỏ cao hoặc quỏ thấp trong thư viện ủó nhõn lờn, ủiều ủú cú nghĩa là cần phải sàng lọc một số lượng vết tan lớn hơn nhiều ủể cú thể phõn lập ủược ủoạn trỡnh tự mong muốn.
IỊ2. Thư viện cADN
Thư viện cADN là tập hợp tất cả cỏc bản sao cADN từ tất cả cỏc mARN của một tế bàọ Khụng giống với thư viện bộ gen, thư viện cADN ủược thiết lập từ một loại tế bào xỏc ủịnh trong ủú gen nghiờn cứu phải ủược biểu hiện thành mARN. Thư viện cADN mang tớnh ủặc trưng tế bào rất cao vỡ ở mỗi loại tế bào của một cơ thể ủó biệt hoỏ chỉ cú một số gen ủược phiờn mó thành mARN. Việc thiết lập thư viờn cADN cũng tuõn theo cỏc nguyờn tắc ủó nờu ở trờn với một ủiểm ủặc trưng là: Trước hết mARN của tế bào ủược tỏch chiết rồi ủược chuyển thành cADN nhờ enzyme phiờn mó ngược. Thư viện cADN ủược thiết lập chủ yếu nhằm mục ủớch nghiờn cứu sự biểu hiện của một gen xỏc ủịnh cựng với những vấn ủề liờn quan như sự ủiều hoà biểu hiện gen, mối tương tỏc giữa cỏc gen trong một quỏ trỡnh sống…Tuy nhiờn, việc phõn tớch kết quả thu ủược từ một thư viện cADN ủũi hỏi phải thận trọng vỡ nhiều lớ do: sự biểu hiện của một gen chịu tỏc ủộng rất lớn của tỡnh trạng sinh lớ tế bào vào thời ủiểm thớ nghiệm, một số gen ủược phiờn mó thành mARN nhưng khụng ủược dịch mó…
Thư viện cADN ủược hỡnh thành theo những bước sau:
+ Việc chọn vector tương ủối dễ dàng do kớch thước của cỏc cADN ớt khi lớn hơn 9kb. Ngày nay thường sử dụng cỏc plasmid thế hệ thứ ba trong việc tỏch dũng cỏc cADN. Plasmid ủược cắt bởi một enzyme giới hạn và hai ủầu mối cắt ủược loại phosphate ủể trỏnh hiện tượng tự nối trở lạị
+ mARN ủược tỏch chiết từ tế bào và ủược chuyển thành cADN nhờ enzyme phiờn mó ngược. Vector tỏi tổ hợp ủược tạo thành do sự kết nối giữa plasmid và cADN.
+ Vector tỏi tổ hợp ủược ủưa vào tế bào vi khuẩn bằng phương phỏp biến nạp: Vi khuẩn ủược nuụi cấy trong mụi trường lỏng ủểủạt ủược một nồng ủộ nhất ủịnh, sau ủú vi khuẩn ủược ủ với calcium chloride (CaCl2) lạnh khiến cho màng tế bào vi khuẩn trở nờn dễ thấm ủối với một ADN lạ. Cỏc tế bào vi khuẩn ủó nhận cỏc vector tỏi tổ hợp ủược nuụi trong mụi trường lỏng một thời gian ngắn trước khi ủem trải chỳng trờn mụi trường ủặc. Cỏc dũng vi khuẩn sẽ hỡnh thành những khuẩn lạc trờn mụi trường thạch.