V. KỸ THUẬT NHÂN AND ĐẶC HIỆU
1. Cỏc loại tế bào vật chủ
ạ/ Cỏc vật chủ nhõn sơ
Một tế bào lý tưởng là một tế bào dễ nuụi cấy và dễ nhõn giống, dễ chấp nhận nhiều loại vector. Vi khuẩn Ẹcoli ủỏp ứng cỏc yờu cầu này và ủược sử dụng trong rất nhiều kỹ thuật tỏch
dũng. Ẹcoli là vi khuẩn gram õm cú một nhiễm sắc thể riờng lẻ nằm trong một cấu trỳc gọi là vựng nhõn (nucleoide). Kớch thước của hệ gen vào khoảng 4.106bp. Cỏc quỏ trỡnh biểu hiện gen (phiờn mó và dịch mó) ủi ủụi với nhau, sinh ra sợi mARN ủược tổng hợp mới và ủược sử dụng ngay cho quỏ trỡnh dịch mó, khụng cú hiện tượng sửa ủổi sau phiờn mó nhưở tế bào nhõn chuẩn. Vỡ vậy Ẹcoli ủược coi là một tế bào vật chủủơn giản nhất.
Ngoài ra cũn cú một số vi khuẩn khỏc cũng ủược dựng làm vật chủ cho cỏc thớ nghiệm tỏch dũng gen như Bacillus, Pseudomonas và Streptomyces. Tuy nhiờn cũng cú những hạn chế nhất ủịnh với cỏc vật chủ nàỵ
b./ Cỏc vật chủ nhõn chuẩn
Một trong những nhược ủiểm khi sử dụng Ẹcoli làm vật chủủể tỏch dũng là ở chỗ nú là sinh vật nhõn sơ nờn khụng cú màng nhõn, ủiều này làm cho một số gen nhõn chuẩn cú thể khụng hoạt ủộng trong Ẹcoli vỡ khỏc với mụi trường bỡnh thường của chỳng. Việc này cú thể gõy khú khăn trong việc phõn lập chỳng bằng cỏc cơ chế chọn lọc phụ thuộc vào biểu hiện gen. Tương tự như vậy, nếu nhằm mục ủớch sản xuất một protein nhõn chuẩn trong một thớ nghiệm tỏch dũng thỡ khú cú thể tin chắc rằng vật chủ nhõn sơ cú thể sản sinh ra một protein cú chức năng ủầy ủủ.
Nấm men Saccharomyces cerevisiae là một vi sinh vật nhõn chuẩn ủược sử dụng nhiều trong cỏc nghiờn cứu kỹ thuật di truyền. Chỳng cú thể sử dụng dễ dàng ủể phõn tớch di truyền học kinh ủiển, chỳng cú rất nhiều loại tế bào ủột biến.
Cỏc tế bào thực vật và ủộng vật cũng cú thểủược sử dụng như cỏc vật chủ trong cỏc thớ nghiệm thao tỏc gen. Tảo ủơn bào, chẳng hạn Chlamydomonas reinhardtii cú tất cả mọi ưu việt của vi sinh vật cộng với cấu trỳc và chức năng của tế bào thực vật, chỳng sẽủược sử dụng ngày càng nhiều trong cỏc thao tỏc di truyền.
2. Cỏc loại vector ủược sử dụng trong tỏch dũng gen
ạ Cỏc vector plasmid
* Tớnh chất
Plasmid là những ủoạn ADN ngắn (2-5kb), dạng vũng, nằm ngoài NST, ủược tỡm thấy ủầu tiờn ở vi khuẩn. Sự sao chộp của plasmid khụng phụ thuộc vào sự sao chộp NST vi khuẩn. Mỗi vi khuẩn cú thể chứa hằng trăm plasmid. Do kớch thước nhỏ nờn plasmid chỉ chứa rất ớt gen chọn lọc, thường ủặc tớnh chọn lọc là tớnh khỏng khỏng sinh. Việc sao chộp của plasmid ủược thực hiện nhờ hàng loạt cỏc enzyme của tế bào chủ. Tuy nhiờn, cỏc plasmid khỏc nhau sử dụng cỏc enzyme khỏc nhau cho nờn mức ủộ sao chộp cũng khỏc nhaụ Trong một số tế bào vi khuẩn, cú loại plasmid cú thểủạt 700 bản sao/1 tế bào, nhưng cũng cú loại chỉủạt 1 bản sao/1 tế bàọ Việc kiểm tra số lượng bản sao ớt hay nhiều ủược kiểm soỏt bằng 1 ủoạn plasmid nằm gần ủiểm origin, là một thành phần cơ bản của plasmid. Cỏc plasmid cựng sử dụng một hệ thống sao chộp khụng thể cựng tồn tại bền vững, giữa chỳng xảy ra hiện tượng khụng dung hợp. Khi hai plasmid giống nhau cựng cho vào một tế bào chỳng sẽ cạnh tranh nhau và 1 trong chỳng sẽ bị loạị
* Cỏc plasmid cơ bản dựng ủể tỏch dũng
- Plasmid thế hệ thứ nhất: Là cỏc plasmid tỡm thấy trong tự nhiờn (ColE1, pSC101…), cú rất ớt cỏc ủặc tớnh cần thiết.
- Plasmid thế hệ thứ hai: Do cỏc nhà nghiờn cứu tạo ra bằng cỏch tập trung cỏc ủặc tớnh quớ của nhiều plasmid tự nhiờn vào một cấu trỳc duy nhất. Vớ dụ như pBR322.
- Plasmid thế hệ thứ ba: Đõy là cỏc plasmid mạnh nhất hiện nay, cú chung 2 ủặc tớnh cơ bản: Kớch thước nhỏ nờn sao chộp rất nhanh trong tế bào vi khuẩn, tạo ra một số lượng bản sao lớn; cú mang một polylinker (hay polycloning site), ủú là một ủoạn polynucleotid tổng hợp tương ứng với một chuỗi cỏc vị trớ nhận biết duy nhất của cỏc RẸ Cỏc plasmid thế hệ thứ ba ủược chia thành 2 nhúm lớn:
+ Nhúm cỏc plasmid pUC: Kớch thước khoảng 2600bp, mang gen ApR và một phần gen lacZ, xen vào giữa gen lacZ là polylinkker. Cỏc thành viờn của nhúm này chỉ khỏc nhau do ủộ dài và chiều của polylinker. Nhúm plasmid này cú ưu ủiểm là: Kớch thước nhỏ; vựng polylinker cho phộp gắn xen gần như bất kỡ một trỡnh tự ADN lạ nào; sự hiện diện của gen lacZ tạo thuận lợi cho việc phỏt hiện vector tỏi tổ hợp chỉủơn giản bằng cỏch quan sỏt màu cỏc khuẩn lạc trờn thạch.
+ Nhúm cỏc plasmid pSP và Gemini: Kớch thước khoảng 3000bp, mang gen ApR và polylinker và khụng mang gen lacZ. Nhưng bự lại, một số plasmid trong nhúm này (pSP64, 56, Gemini) cú mang promotor ủặc trưng cho cỏc ARN polymerase (SP6,T7) ở hai bờn vựng polylinker. Do ủú ưu ủiểm chủ yếu của nhúm này là cho phộp phiờn mó ủoạn ADN gắn trong vector thành rất nhiều ARN. Cỏc ARN này thường ủược dựng làm mẫu dũ hay dựng trong nghiờn cứu cấu trỳc, chức năng ARN.
+ Nhúm cỏc plasmid Bluescript: Cỏc plasmid này kết hợp ủược tất cả những ưu ủiểm của cỏc nhúm trờn và ủược xem là nhúm cú tiềm năng nhất hiện naỵ