ở Eukaryote có 3 loại ARN polymerase khác nhau, đều là những enzym lớn chứa ít nhất 12 tiểu đơn vị, t−ơng ứng với các tiểu đơn vị trong lõi enzym ARN polymerase của Ẹ coli. Các gen mã hóa cho 2 tiểu đơn vị lớn nhất của mỗi polymerase có tính t−ơng ứng lẫn nhaụ Tiểu đơn vị lớn nhất và tiểu đơn vị lớn thứ hai t−ơng tự với tiểu đơn vị β’ và β của polymerase trong
Ẹ coli và tiểu đơn vị lớn thứ hai cũng chứa vị trí vận động. Hai tiểu đơn vị nói trên là chung
cho cả ARN pol I và pol III, ngoài ra có một tiểu đơn vị khác đặc hiệu cho ARN - pol II t−ơng ứng với tiểu đơn vị α của ARN pol ở Ẹ coli. Có ít nhất 5 tiểu đơn vị là chung cho các enzym. Mỗi enzym còn chứa từ 4 đến 7 tiểu đơn vị chỉ có mặt trong loại đó mà không có ở loại khác. Các phức hệ của ARN polymarase có chức năng phiên mã những loại gen khác nhau, có độ mẫn cảm khác nhau đối với độc tố α-amanitin của nấm và có thể đ−ợc phân biệt theo hoạt động của chúng:
+ ARN pol I phiên mã hầu hết các gen mã hoá rARN, nằm trong hạch nhân (nhân nhỏ) và không mẫn cảm với độc tố nấm α-amanitin. ARN pol I cũng có cấu trúc t−ơng tự nh− các ARN pol khác, nh−ng vắng mặt đuôi C, điều này sẽ giúp giải thích tại sao sản phẩm phiên mã của nó không bao giờ gắn mũ hay có đuôi poly (A). Và sự khác biệt này sẽ giúp tế bào phân biệt giữa ARN không mã hoá và mARN.
+ ARN pol II phiên mã tất cả gen mã hoá protein và một số gen mã hoá snARN, nằm trong dịch nhân và rất mẫn cảm với α-amanitin. Tiền ARN phải đ−ợc chế biến sau khi tổng hợp bởi việc hình thành mũ, gắn đuôi poly (A) và cắt intron ở trong nhân tr−ớc khi đi ra tế bào chất để tham gia tổng hợp protein.
+ ARN pol III là một phức hệ gồm ít nhất 16 tiểu đơn vị, nằm trong nhân và mẫn cảm trung bình với α-amanitin. ARN polIII có vai trò trong việc tổng hợp tARN, tiền 5S rARN, các snARN và các ARN nhỏ khác
Bên cạnh những enzym trong nhân, tế bào eukaryote chứa những polymerase bổ sung trong ty thể và lạp thể.
Giống nh− ARN polymerase của vi khuẩn, trong tế bào eukaryote, mỗi enzym xúc tác quá trình phiên mã theo chiều 5’ 3’ và tổng hợp ARN bổ sung với sợi khuôn antisensẹ Phản ứng yêu cầu các tiền nucleotid (NTP) và không yêu cầu mồi để khởi đầu phiên mã. Không giống nh− ở vi khuẩn, ARN polymerase ở eukaryote cần sự có mặt của protein khởi đầu tr−ớc khi chúng có thể liên kết với promotor và khởi đầu phiên mã.
2. Promotor
ạ Promotor ở prokaryote
ARN polymerase liên kết với các vị trí khởi đầu đặc hiệu nằm tr−ớc các trình tự đ−ợc phiên mã, gọi là promotor. Các promotor khác nhau đ−ợc nhận ra bởi các nhân tố σ khác nhaụ
Promotor lần đầu tiên đ−ợc mô phỏng thông qua đột biến làm tăng lên hay giảm bớt tỷ lệ phiên mã của các gen lac-operon. Trình tự promotor nằm ở điểm bắt đầu phiên mã (đ−ợc ký hiệu là vị trí +1). Để phù hợp với điều này, các trình tự promotor đ−ợc ký hiệu là một số âm phản ánh khoảng cách ng−ợc kể từ điểm khởi đầụ Đột biến di truyền của Ẹ coli cho thấy chỉ một đoạn các trình tự rất ngắn đ−ợc bảo tồn là quyết định chức năng promotor.
Hình 3.2: Trình tự các promotor ở một số sinh vật
Promotor σ70 bao gồm một chuỗi polynucleotid khoảng từ 40 đến 60bp. Vùng nằm trong khoảng -55 đến +20 liên kết với polymerase, và vùng nằm trong khoảng từ -20 đến +20 đ−ợc bảo vệ chắc chắn khỏi sự phân huỷ của ADNase I, ngăn cản sự đến gần của nuclease với ADN. Đột biến di truyền của các trình tự promotor cho thấy các trình tự nằm xung quanh vị trí -40 là cần thiết cho chức năng promotor. 6 base ở xung quanh vị trí -10 và -35 có tầm quan trọng đặc biệt với chức năng của promotor trong Ẹ coli.
+ Trình tự -10: đ−ợc bảo toàn nhất ở promotor σ70, là một đoạn 6bp. Trình tự này nằm quanh vị trí -10 so với điểm bắt đầu phiên mã, có một trình tự liên ứng là TATAAT, còn đ−ợc gọi là hộp pribnow (đ−ợc Pribnow tìm thấy năm 1975). Hai base đầu tiên và base cuối cùng đ−ợc bảo tồn cao nhất. 6 base này cách điểm khởi đầu phiên mã khoảng 5-8bp. Các base xen giữa không đ−ợc bảo tồn mặc dù khoảng cách 5-8bp là quan trọng. Đây chính là trình tự mà ADN bắt đầu đ−ợc tháo xoắn bởi ARN polymerasẹ
+ Trình tự -35: Xung quanh vị trí -35 có một bộ 6base có trình tự liên ứng TTGACA đ−ợc bảo tồn nhất trong promotor, đặc biệt là 3base đầu tiên. Trình tự này cách hộp pribnow khoảng 16-18bp trong tổng số 90% các promotor. Các trình tự xen giữa các yếu tố bảo tồn này không quan trọng.
Các gen có điểm bắt đầu phiên mã chứa base purin chiếm đến 90%. Điểm khởi đầu (vị trí +1) có G phổ biến hơn Ạ Thông th−ờng các base C và T nằm bên cạnh nucleotid khởi đầu phiên mã ( ví dụ: CGT hay CAT).
--TTGACA---16-18bp---TATAAT---5-8bp---C(G/A)T---
-35 -10 +1
Những trình tự đ−ợc mô tả ở trên là những trình tự liên ứng mẫu mực. Tuy nhiên, có sự khác nhau trong trình tự giữa các promotor khác nhau, và chúng có thể thay đổi hiệu quả phiên mã hơn 1000 lần.
Tóm lại, chức năng của các vùng promotor khác nhau có thể đ−ợc xác định nh− sau:
Trình tự thừa nhận
. Trình tự -35 là thành phần của vùng nhận biết, làm tăng c−ờng sự nhận biết và t−ơng tác với tiểu đơn vị σ của ARN pol.
. Vùng -10 rất quan trọng cho sự tháo xoắn ADN và là trình tự cơ bản của σ.
. Những trình tự xung quanh điểm bắt đầu phiên mã ảnh h−ởng đến sự khởi đầu phiên mã.
Promoter structure in prokaryotes
5’ PuPuPuPuPuPuPuPu AUG Promoter +1 +20 -7 -12 -31 -36 5’ mRNA mRNA TTGACA AACTGT -30 region TATAAT ATATTA -10 region 84 79 53 45% 82 T T G 64 A C A 79 T 44 T 96% T 95 A 59 A 51 A consensus sequences -30 -10
transcription start site
Pribnow box
+1
[ ]
Hình 3. 3 : Câú trúc promotor điển hình ở prokaryote
Trình tự 30 base đầu tiên đ−ợc phiên mã cũng ảnh h−ởng đến quá trình phiên mã. Trình tự này điều khiển tỷ lệ σ rời khỏi promotor, cho phép khởi động lại phức hệ ARN pol khác, do đó ảnh h−ởng đến tỷ lệ phiên mã và độ bền của promotor. Tầm quan trọng của sự tách rời mạch trong phản ứng khởi đầu là do ảnh h−ởng xoắn âm của sợi khuôn ADN làm tăng c−ờng khởi đầu phiên mã vì cấu trúc siêu xoắn này cần ít năng l−ợng để tháo xoắn ADN hơn. Một số promotor không có khả năng đ−ợc phiên mã hoàn toàn d−ới điều kiện bình th−ờng. Ví dụ: Lac promotor (P lac) yêu cầu một yếu tố hoạt hoá phụ gọi là protein tiếp nhận AMP vòng (cAMP receptor protein CRP) để liên kết vào một vị trí trên ADN, giúp cho promotor tăng c−ờng khả năng liên kết và khởi đầu phiên mã. Những promotor khác, nh− promotor của gen sốc nhiệt bao gồm các trình tự promotor liên ứng khác nhau có thể đ−ợc nhận ra bởi một ARN pol trong đó yếu tố σ khác với yếu tố σ70.