Từ việc định hướng qui trình nghiên cứu sản xuất insulin tái tổ hợp theo
mơ hình mini-proinsulin trong phần Tổng quan (1.8), các kết quả thu nhận được
trong quá trình nghiên cứu và dựa vào các thiết bị sẵn cĩ, chúng tơi xây dựng qui trình cơng nghệ để sản xuất insulin qui mơ pilot với thể tích bình lên men là 80
Luận án Tiến sĩ Kết quả –Biện luận
lít. Sơ đồ được trình bày trên Hình 3.30. Các bước quan trọng của qui trình bao gồm:
Chủng E. coli BL21(DE3)/pET43Ins cĩ khả năng biểu hiện vượt mức MPI
được hoạt hĩa trên mơi trường LB-Agar ở 37oC trong vịng 16 giờ và được nhân
giống qua hai cấp trong mơi trường LBp cĩ bổ sung ampicillin với thể tích tăng
dần từ 200 ml đến 4 L. Nhiệt độ nuơi cấy của giai đoạn nhân giống là 37oC sau
thời gian khoảng 7 giờ thì kết thúc. Quá trình lên men chính được thực hiện theo phương pháp mẻ-bổ sung trong bình lên men với thể tích cuối đạt 80 L, trong đĩ mơi trường ban đầu là 43 L và Mơi trường bổ sung nạp vào là khoảng 37 L. Mơi
trường lên men sử dụng là aH-LBp, và cảm ứng biểu hiện bằng IPTG ở nhiệt độ
30oC trong 20 giờ. Sinh khối tế bào (khơ) sau lên men đạt khoảng 2109 g, được
thu nhận bằng cách ly tâm ở 6000 vịng/phút trong 15 phút. Qua quá trình đồng hĩa tế bào thu nhận thể vùi và tinh chế thu nhận 6xHis-MPI, lượng 6xHis-MPI cĩ thể thu nhận được khoảng 16,77 g. Tiến hành cắt loại 6xHis bằng CNBr để thu nhận được khoảng 3,4 g MPI và thực hiện tái gấp cuộn để thu nhận được 1,47 g MPI cấu hình tự nhiên. Sau đĩ xử lý bằng trypsin để cắt loại đoạn peptide C để thu nhận insulin tái tổ hợp cĩ hoạt tính.
Luận án Tiến sĩ Kết quả –Biện luận
Luận án Tiến sĩ Kết luận - Đề nghị
KẾT LUẬN - ĐỀ NGHỊ
4.1.Kết luận
Từ các kết quả thu nhận được trên đây, chúng tơi cĩ thể kết luận rằng đã xây dựng được qui trình cơng nghệ tổng hợp insulin theo mơ hình mini-proinsulin bằng chủng E. coli tái tổ hợp. Cụ thể như sau:
1. Đã tổng hợp thành cơng gen mpi mã hĩa insulin người tái tổ hợp theo mơ
hình mini-proinsulin bằng kỹ thuật PCR tái tổ hợp cĩ trình tự tương ứng với trình tự gen đã được cơng bố ở ngân hàng gen.
2. Đã dịng hĩa thành cơng gen mã hĩa insulin tái tổ hợp (mpi) này vào
plasmid pET-43.1a tạo plasmid pET43Ins mang gen mpi và biến nạp
vector này vào chủng E. coli BL21(DE3) tạo dịng E. coli BL21(DE3)/
pET43Ins cĩ khả năng biểu hiện mini-proinsulin ở dạng protein dung hợp 6xHis-MPI.
3. Đã xác lập được điều kiện cảm ứng biểu hiện 6xHis-MPI tối thích của
chủng: nhiệt độ cảm ứng 30oC, nồng độ IPTG 0,3 mM, thời lượng cảm
ứng 20 giờ.
4. Đã xác định được thành phần mơi trường (aH-LBp) và điều kiện nuơi cấy
chủng E. coli BL21(DE3)/pET43Ins để đạt mật độ cao bằng phương pháp
lên men mẻ-bổ sung ở qui mơ phịng thí nghiệm 5 L. Đã cảm ứng biểu hiện thu nhận được mini-proinsulin dung hợp với thẻ 6xHis dạng thể vùi trong tế bào chất.
Luận án Tiến sĩ Kết luận - Đề nghị
5. Đã tiến hành lên men cảm ứng biểu hiện 6xHis-MPI thành cơng bằng
phương pháp mẻ-bổ sung trên hệ thống lên men pilot với thể tích dịch lên men là 30 L.
6. Đã thu nhận thành cơng 6xHis-MPI từ thể vùi trong tế bào E. coli
BL21(DE3)/pET43Ins được lên men ở qui mơ phịng thí nghiệm và qui mơ pilot-30 L đạt hiệu suất 0,8% sinh khối.
7. Đã thu nhận thành cơng MPI từ 6xHis-MPI bằng cách xử lý với CNBr.
8. Đã tái gấp cuộn thành cơng MPI cĩ cấu hình tự nhiên từ MPI biến tính với
hiệu suất đạt 43,18%.
9. Đã tiến hành cắt loại đoạn peptide C tạo insulin cĩ hoạt tính.
4.2. Đề nghị
1. Nghiên cứu tối ưu hĩa các điều kiện lên men, cảm ứng biểu hiện để đạt
được hiệu suất biểu hiện protein mục tiêu mini-proinsulin cao nhất.
2. Mở rộng tạo dịng và biểu hiện mini-proinsulin trên các hệ thống biểu
hiện khác như nấm men, Bacillus subtilis để khảo sát khả năng biểu hiện
mini-proinsulin dưới các dạng tan trong tế bào chất hay tiết ra mơi trường.
3. Khảo sát các điều kiện để tăng cường hiệu suất cắt loại thẻ 6xHis bằng
CNBr ra khỏi 6xHis-MPI.
4. Khảo sát các điều kiện để tăng cường hiệu suất tái gấp cuộn MPI và hiệu
suất cắt loại đoạn peptide C ra khỏi MPI.
5. Nghiên cứu tinh chế thu nhận insulin tái tổ hợp ở dạng tinh sạch và
nghiên cứu tinh thể hĩa insulin để phục vụ cho quá trình sản xuất sau này.
6. Tăng cường độ lặp lại của các thí nghiệm để cĩ cơ sở kết luận vững chắc
Luận án Tiến sĩ Danh mục cơng trình đã cơng bố
DANH MỤC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
1. Chu Kỳ Nam, Hồng Văn Quốc Chương, Trần Linh Thước (2005), Tạo
dịng và biểu hiện mini-proinsulin của người tái tổ hợp trong Escherichia
Coli, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 3 (2): 155-160.
2. Hoang Van Quoc Chuong, Nguyen Thanh Hoa, Tran Linh Thuoc (2008),
Studying on high density cell cultivation of E. coli BL21(DE3)/pET43Ins by fed-batch. Journal of Biotechnology, Volume 136, Supplement 1, pages S516-517.
3. Hoang Van Quoc Chuong, Nguyen Van Nhung, Tran Linh Thuoc (2005),
Study on medium component and condition to synthesize the recombinant human mini-proinsulin in E. coli at pilot scale fermentation, Regional Symposium on Chemical Engineering- New trends in Technology towards sustainable development, Proceedings, pp. 336-340.
4. Hồng Văn Quốc Chương, Nguyễn Thanh Hoa, Trần Linh Thước (2008),
Thu nhận mini-proinsulin cĩ cấu hình gấp cuộn từ protein tái tổ hợp dạng thể vùi được biểu hiện trong E. coli. Hội nghị Khoa học tồn quốc lần thứ IV- Hĩa sinh và sinh học phân tử phục vụ nơng, sinh, y học và cơng nghiệp thực phẩm, Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật, tr.673-676.
Các cơng trình liên quan đến luận án tham gia dự thi đạt giải:
5. Chu Kỳ Nam, Nguyễn Văn Nhung, Hồng Văn Quốc Chương (2005),
Tạo dịng, biểu hiện mini-proinsulin người tái tổ hợp trong Escherichia coli và khảo sát một số điều kiện nuơi cấy, sản xuất ở qui mơ pilot. Cuộc thi “Sáng tạo khoa học cơng nghệ lần I – 2005” do Khu Cơng nghệ cao Tp.HCM tổ chức (giải nhất).
6. Chu Kỳ Nam, Nguyễn Văn Nhung, Hồng Văn Quốc Chương (2005) Tạo
dịng, biểu hiện mini-proinsulin người tái tổ hợp trong Escherichia coli và khảo sát một số điều kiện nuơi cấy, sản xuất ở qui mơ pilot. Hội thi sáng tạo khoa học kỹ thuật Tp.Hồ Chí Minh năm 2005 (giải nhì).
Luận án Tiến sĩ Tài liệu tham khảo
TAØI LIỆU THAM KHẢO
1. Tiếng Việt
1. Tạ Văn Bình (2009), Bài phát biểu tại lễ cơng bố Chiến lược xã hội hĩa thực
hiện mục tiêu quốc gia phịng chống Bệnh đái tháo đường, thành phố Hồ Chí Minh.
2. Stephen Colagiuri, Tạ Văn Bình (2004), Phịng và quản lý bệnh đái tháo
đường tại Việt nam, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.
3. Đỗ Quí Hải (2004), Hĩa sinh, Nhà xuất bản Đại học Huế.
4. Cao Đăng Nguyên, Đỗ Quí Hải (2002), Cơng nghệ protein, Nhà xuất bản Đại
học Huế.
5. Phạm Thị Kim Trâm, Trần Thị Thúy Hằng, Nguyễn Quốc Bình (2008), “Biểu
hiện protein sinh dược (insulin, Interferon alpha 2b) trong Pichia pastoris”,
Hội nghị Khoa học tồn quốc lần thứ IV- Hĩa sinh và sinh học phân tử phục vụ nơng, sinh, y học và cơng nghiệp thực phẩm, Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật, tr. 568-571.
6. Nguyễn Trọng Tuệ, Lê Văn Phủng, Chom Kyu Chong, Lee Sang Oh (2007),
“Nghiên cứu biểu hiện proinsulin người trên vector pET-28A(+) trong tế bào
Escherichia coli BL21(DE3)”, Tạp chí nghiên cứu Y học, ISSN 0868-202X, Tập 47, số 2, tr. 11-15.
7. Trần Hồng Vân, Nguyễn Trọng Tuệ, Lê văn Phủng (2008), “Nghiên cứu một
số điều kiện tối ưu trong biểu hiện proinsulin người tái tổ hợp ở E. coli
BL21(DE3) với vector pET-28a(+)”, Tạp chí nghiên cứu Y học ISSN 0886- 202X, tr. 56-61.
2. Tiếng Anh
8. Amersham pharmacia biotech, pGEX vectors (GST Gene Fusion System),
Third Edition, Rev. 2, 18-1123-20 (http://www.amershambiosciences.com).
9. Amersham, GST Gene Fusion System Handbook, Edition AA, 18-1157- 58
Luận án Tiến sĩ Tài liệu tham khảo
10.Andersen L., Dinesen B., Jorgensen P.N., Poulsen F., Roder M.E. (1993),
“Enzyme immunoassay for intact human insulin in serum or plasma”. Clinical
Chemistry, 39, pp. 578-582.
11.Ausubel F., Brent R., Kingston R.E., Moore D.D., Seidman J.G., Smith J.A., Struhl K. (1992), Short protocols in molecular biology, Third edition, Wiley, USA.
12.Baker T. A., Grossman A. D., Gross C. A. (1984), “A gene regulating the heat
shock response in Escherichia coli also affects proteolysis”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, pp. 6779-6783.
13.Berg H., Walter M., Mauch L. (1993), “Expression human preproinsulin-
Expression, purification and reaction with insulin autoantibodies in sera from
patients with insulin-dependent diabetes mellitus”, Journal of Immunological
Methods, 164, pp. 211-231.
14.Cabrita L.D., Bottomley S.P. (2004), “Protein expression and refolding- a
practical guide to getting the most out of inclusion bodies”, Biotechnol. Annu.,
Rev. 10, pp. 31-50.
15.Chang S.G., Choi K.D., Kim D.Y., Kang H.T., Song M.C., Shin H.C. (2002),
“The role of β-turn in the folding of mini-proinsulin”, Bull. Korean Chem Soc., 23(10), pp. 1369-1370.
16.Chang S.G., Kim D.Y., Choi K.D., Shin J.M., Shin H.C. (1998), “Human
insulin production from a novel mini-proinsulin which has high receptor- binding activity”, Biochem J., 329 (3), pp. 631-635.
17.Chen J.Q., Zhang H.T., Hu M.H., Tang J.G. (1995), “Production of human
insulin in an E. coli system with Met-Lys-human proinsulin as the expressed
precursor”, Appl Biochem Biotechnol, 55(1), pp. 5-15.
18.Chen X. F., Chen C., Wu D. H., Huai H., Chi X. C. (1997), “A new
baculovirus of cultured shrimp”, Sei. China Ser. C40, pp. 630-635. 19.Clark E.D. (2001), “Protein refolding for industrial processes”, Current
opinion in Biotechnology, 12(2), pp. 202-207.
20. Clark E.D.B. (1998), “Refolding of recombinant proteins”, Curr. Opin. Biotechnol., 9, pp. 157-163.
Luận án Tiến sĩ Tài liệu tham khảo
21.Dabrowski S., Brillowska A., Kur J. (1999), “Use of the Green Fluorescent
Protein Variant (YFP) to monitor MetArg human proinsulin production in
Escherichia coli”, Protein Expression and Purification 16, pp. 315–323.
22.Dodoson G.G., Whittingham J.L., “Insulin structure and diabetes treatment”
(http://www.yorvic.york.ac.uk/projects/3/3.5.htm).
23.Dorschug et al (2005), “Mini-proinsulin, its preparation and use”. United state patent, US 6,875,589 B1, USA.
24. Fang M., Huang H.L. (2001), “Advances in in vitro refolding of inclusion
body proteins”, Chinese Journal of Biotechnology, 17(6), pp. 608-12.
25.Fernandez J.M., Hoeffler J.P. (1999), “Gene expression systems. Using
nature for the art of expression”, Academic Press, San Diego.
26.Fikrig E., Barthold S.W., Kantor F.S., et al (1990), “Protection of mice against the Lyme Disease agent by immunizing with recombinant OspA”,
Science, 250, pp. 553-556.
27.Gary Walsh (2002), Proteins-biochemistry and biotechnology, John Wiley & Sons Ltd.
}
28.Glick B. J., Pasternak J.J. (2003), Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA, 3rd edition, American Society for Microbiology, USA.
29.Hénaut, Danchin (1996), “Codon Usage in E. coli; Analysis and Predictions
from Escherichia coli sequences”, Escherichia coli and Salmonella, 2(114),
pp. 2047-2066, Neidhardt FC ed., ASM press, Washington, D.C.
30.Invitrogen (2006), Ni-NTA purification system for purification of polyhistidine- containing recombinant proteins, User manual, Invitrogen corporation, USA
31.Jonasson P., Nilsson J., Samuelsson E., Moks T., Stahl S., Uhlen M. (1996),
“Single-step trypsin cleavage of a fusion protein to obtain human insulin and its C peptide”, Eur J Biochem., 236(2), pp. 656-61.
32. Jungbauer A., Kaar W. (2007), “Current status of technical protein refolding”, Journal of Biotechnology, 128(3), pp. 587-596.
33.Kaelin W.G.Jr., Krek W., Sellers W.R., DeCaprio J.A., Ajchenbaum F., Fuchs
Luận án Tiến sĩ Tài liệu tham khảo
“Expression cloning of a cDNA encoding a retinoblastomabinding protein with E2F-like properties”, Cell., 70(2), pp. 351-364.
34.Kang Y., Yoon J.W. (1994), “Effect of modification of connecting peptide of
proinsulin on its export”. J. Biotechnol., 36(1), pp. 45-54.
35.King K.M., Rubin G. (2003), “A history of diabetes: from antiquity to
discovering insulin”, British journal of nursing, 12(8), pp. 1091-1095.
36.Kjeldsen T, Pettersson A.F., Hach M. (1999), “Secretory expression and
characterization of insulin in Pichia pastosis”, Biotechnology & Applied
Biochemistry, 29, pp. 79-86.
37.Kjeldsen T. (2000), “Yeast secretory expression of insulin precursors”, Appl
Microbiol Biotechnol., 54, pp. 277-86.
38.Knorre W.A., Deckwer W.D., Korz D., Pohl H.D., Riesenberg D., Ross A.,
Sanders E., Schulz V. (1991), “High cell density fermentation of recombinant
Escherichia coli with computer-controlled optional growth rate”, Annals NewYork Academy of Sciences, 646(1), pp. 300-306.
39.Kroeff E.P., Owens R.A., Campbell E.L., Johnson R.D., Marks H.I. (1989),
“Production scale purification of Biosynthetic human insulin by reversed-
phase high-performance liquid chromatography”, Journal of chromatography,
461, pp. 45-61.
40.Leon O., Roth M. (2000), “Zinc fingers: DNA binding and protein-protein
interactions”, Biological research. Biol. Res. v-33 n.l.
41.Lewcock A. (2007), “Cost-cutting plant-based insulin to hit market by 2010”
(http://www.in-pharmatechnologist.com/Materials-Formulation/Cost-cutting- plant-based-insulin-to-hit-market-by-2010).
42.Lightner D.V. (1996), a handbook of shrimp pathology and diagnostic
procedures for for disease of cultured penaeid shrimp, World aquaculture
Society, Baton Rouge, Lousiana, USA.
43. Lilie H., Schwarz E., Rudolph R. (1998), “Advances in refolding of protein produced in E. coli”, Current opinion in Biotechnology, 9(5), pp. 497-501.
44.Luli G. W., Strohl W.R. (1990), “Comparison of growth, acetate production,
Luận án Tiến sĩ Tài liệu tham khảo
fermentations”, Applied and environmental microbiology, 56(4), pp.1004-
1011.
45.Microfluidics (2006), User Manual, Model M-110EH-30 Microfluidizer®
Processor, Part No.85.0004.
46.Mierendorf R., Yeager K., Novy R. (1994), “pET system: Your choice for
expression”, News letter of Novagen Inc., 1(1).
47.New England Biolabs (2005), Tools for Protein Research, New England
Biolabs Inc., Ipswich, USA
48.New England Biolabs, IMPACTTM I: One-step protein purification system,
Purification of recombinant by a self- cleavable affinity tag, version 1.8, New England Biolabs Inc., Ipswich, USA
49.Nilsson J., Jonasson P., Samuelsson E., Stahl S., Uhlen M. (1996), “Integrated
production of human insulin and its C-peptide”. Journal of Biotechnol., 48(3),
pp 241-250.
50.Nilsson J., Stahl S., Lundeberg J., Uhlen M., Nygren P.A. (1997), “Affinity
Fusion Strategies for Detection, Purification, and Immobilization of
Recombinant Proteins”, Protein Expression And Purification, 11, pp. 1–16,
Article No. PT970767.
51.Novagen (2006), pET System Manual, TB055 11th Edition, Rev.B 0403, USA
800-207-0144.
52.Olmos-Soto J, Contreras-Flores R. (2003), “Genetic system constructed to
overproduce and secrete proinsulin in Bacillus subtilis”. Appl Microbiol
Biotechnol., 62, pp. 369-373.
53.Pais J.M., Varas L., Valdes J., Cabello C., Rodriguez L., Mansur M. (2003),
“Modeling of mini-proinsulin production in Pichia pastoris using the AOX
promoter”, Biotechnol Lett., 25(3), pp. 251-255.
54.Rodney J.Y. Ho, Gibadi M. (2003), Biotechnology and Biopharmaceuticals -
Transforming proteins and genes into drugs, Wiley-Liss,USA.
55.Rossini A.A., Like A.A., Chick W.L., Appel M.C., Cahill G.F. (1977),
“Studies of streptozotocin-induced insulitis and diabetes”, Proc. Acad. Sci.
Luận án Tiến sĩ Tài liệu tham khảo
56.Sambrook J., Rusell D.W. (2001), Molecular cloning, a laboratory manual,
Third Edition, Cold Spring Habor, New york, USA.
57.Schmidt M., Babu K.R., Khanna N., Marten S., Rinas U., (1999),
“Temperature-induced production of recombinant human insulin in high-cell
density cultures of recombinant Escherichia coli”, Journal of Biotechnology,
68, pp. 71-83.
58.Shiloach J., Fass R. (2005), “Growing E. coli to high cell density-A historical
perspective on method development”, Biotechnology Advances, 23, pp. 345-
537.
59.Shin C.S., Hong M.S., Bae C.S., Lee J. (1997), “Enhanced production of
Human Mini-Proinsulin in Fed-Batch culture at high cell density of
Escherichia coli BL21(DE3)[pET-3aTM2]”, Biotechnol. Pro., 13, pp, 249-257.
60.Stahl S.J., Christiansen L. (1988), “Selection for signal sequence mutations
that enhance production of secreted human proinsulin by Escherichia coli”.
Gene., 71(1), pp. 147-156.
61.Stanbury P.F., Whitaker A., Hall S.J. (1995), Principles of Fermentation
Technology, Second edition, Pergamon, USA.
62.The QIAexpressionistTM (2003), A handbook for high-level expression and
purification of 6xHis-tagged proteins, Fifth edition, QIAGEN, Germany.
63.Tjissen P. (1985), Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular
Biology, vol. 15, Practice and Theory of Enume Immunoassqs, Elsevier, New