Mẫu mini-proinsulin tái gấp cuộn thu được ở phần trên được tiến hành xử lý cắt loại đoạn peptide C bằng trypsin theo phương pháp được mơ tả trong mục
2.4.17. Dung dịch sau phản ứng thủy phân được kiểm tra bằng phương pháp điện di SDS-PAGE và đánh giá cấu hình tự nhiên của insulin tái tổ hợp bằng phương pháp RP-HPLC. Kết quả kiểm tra phản ứng cắt loại peptide C ra khỏi cấu trúc MPI tái gấp cuộn bằng phương pháp điện di SDS-PAGE được ghi nhận trên Hình
3.27. Ở giếng 4, mẫu dung dịch MPI sau khi cắt loại đoạn peptide C cĩ xuất hiện
vạch protein đậm cĩ kích thước khoảng 5,8 kDa tương ứng với vạch insulin chuẩn (giếng 2). Như vậy trong dung dịch sau phản ứng cắt cĩ chứa insulin, được hình thành từ việc cắt loại đoạn peptide C ra khỏi cấu trúc MPI tái gấp cuộn. Mặt khác, trong giếng 4 cịn xuất hiện một vạch protein nhạt hơn cĩ kích thước tương ứng với MPI trong giếng 3. Cĩ thể đây là MPI tái gấp cuộn cịn lại trong dung dịch sau phản ứng mà nguyên nhân là phản ứng cắt loại peptide C khơng đạt hiệu quả tối ưu.
Từ kết quả thu được cĩ thể khẳng định rằng đã cắt loại được peptide C ra khỏi MPI tái gấp cuộn.
Luận án Tiến sĩ Kết quả –Biện luận
Hình 3.27. Kết quả kiểm tra sự cắt loại petide C bằng điện di SDS-PAGE.
Giếng 1, thang protein; 2, Iinsulin chuẩn; 3, MPI tái gấp cuộn trước khi cắt; 4, Dịch MPI tái gấp cuộn sau khi cắt bằng trypsin.
Kết quả kiểm tra cấu hình insulin tái tổ hợp thu nhận được bằng sắc ký
ngược pha RP-HPLC được trình bày trên Hình 3.28. Kết quả cho thấy khoảng
phút thứ 29,5 cĩ xuất hiện một peak khoảng 600 mAU tương ứng với thời gian lưu giữ của insulin chuẩn trên cột (Hình 3.26).
Kết quả này cho phép khẳng định rằng insulin tái tổ hợp thu nhận được cĩ cấu hình tự nhiên.
14,4 20,1
Luận án Tiến sĩ Kết quả –Biện luận m 0 10 20 30 40 50 60 mAU -100 0 100 200 300 400 500 VWD1 A, Wavelength=215 nm (INSULIN\090827H1.D)
Hình 3.28. Kết quả phân tích dịch cắt loại đoạn peptide C bằng trypsin theo phương pháp RP-HPLC.