Hệ thống vector biểu hiện pET cho phép dịng hĩa và biểu hiện protein
tái tổ hợp ở dạng dung hợp với một homooligohistidine (6xHis) trong tế bào E.
coli. Sự biểu hiện của gen mục tiêu được kiểm sốt bởi promotor T7 và nhờ hoạt
tính của T7 RNA polymerase của tế bào chủ được biến đổi bởi phage T7 (Hình
1.9). Vector biểu hiện này chứa đoạn DNA mã hĩa oligo-histidine gọi là thẻ His
(His-tag), đoạn này cĩ thể chứa 6 hoặc 8 hoặc 10 amino acid. Tùy theo plasmid mà His-tag cĩ thể dung hợp ở đầu N hay đầu C hay nằm ở giữa protein dung hợp với vai trị hỗ trợ việc tinh chế protein mục tiêu và cịn giúp cho sự phát hiện protein mục tiêu ở dạng dung hợp nhờ kháng thể chuyên biệt với His-tag. Protein tái tổ hợp chứa 6xHis cĩ thể được thu hồi với độ tinh sạch trên 90% bằng
Luận án Tiến sĩ Tổng quan
giữa 6xHis và Ni2+ (Hình 1.10) sau đĩ ly giải ở pH thấp hoặc dùng chất kìm cạnh
tranh là imidazone [46],[51].
Hình 1.9. Cấu trúc vector biểu hiện pET 43-1a(+).
Luận án Tiến sĩ Tổng quan 1.5.3. Hệ thống biểu hiện dung hợp với MBP - Hệ thống pMAL
Trong hệ thống này, gen mã hĩa protein mục tiêu được chèn vào vector
pMAL ở vùng hạ lưu từ gen malE, mã hĩa cho protein kết gắn maltose, MBP
(Maltose Binding Protein). Hệ thống này sử dụng promotor mạnh Ptac để biểu
hiện một lượng lớn protein dung hợp, sau đĩ được thu nhận bằng sắc ký ái lực
dựa vào ái lực đặc trưng của MBP với amylose (Hình 1.11) [48]. Hệ thống pMAL
cĩ khả năng biểu hiện cả ở tế bào chất và chu chất với mức độ biểu hiện cao (100 mg / L) trong E. coli và làm tăng tính tan của protein dung hợp [50].
Hình 1.11. Sơ đồ biểu hiện và thu nhận các protein cĩ gắn thẻ MBP.
1.5.4. Hệ thống IMPACT biểu hiện protein dung hợp với CBP
Đặc điểm nổi bật của hệ thống IMPACT (Intein Mediated Purification with an Affinity Chitin-binding) là tính năng tự cắt các đoạn protein dung hợp
(intein) trong thu nhận và tinh chế protein tái tổ hợp (phân tử intein từ Sac.
Luận án Tiến sĩ Tổng quan
hiện phản ứng tự cắt liên kết peptide khi được cảm ứng ở 4oC với các tác nhân
thiol như DTT (1,4-Dithiothreitol), β-Mercaptoethanol hoặc cysteine. Trong hệ
thống này gen mã hĩa intein thường nằm ở đầu 3’ của gen mục tiêu, tiếp theo là đoạn gen mã hĩa cho vùng gắn chitin, chitin-binding domain (CBD), kích thước
5 kDa từ Bacillus circulan. Khi được nạp vào cột chitin, protein dung hợp với
CBP sẽ được giữ lại. Sau khi thực hiện phản ứng cắt của intein ở 4oC bởi DTT
hoặc β-Mercaptoethanol, protein mục tiêu được ly giải khỏi cột.
Hình 1.12. Sơ đồ biểu hiện và tinh chế sử dụng hệ thống gắn thẻ Chitin.
1.6.Phương pháp lên men vi sinh vật
1.6.1. Các phương pháp lên men sản xuất protein tái tổ hợp
Lên men E. coli để sản xuất protein tái tổ hợp cĩ thể được thực hiện theo
Luận án Tiến sĩ Tổng quan
Trong phương pháp lên men mẻ, chủng vi sinh được cấy vào mơi trường dinh dưỡng với một tỷ lệ thích hợp, quá trình lên men bắt đầu diễn ra mà khơng cĩ sự bổ sung bất kỳ nguồn dinh dưỡng nào. Trong phương pháp lên men mẻ-bổ sung, chất dinh dưỡng được bổ sung tăng dần lên ở những thời điểm khác nhau mà khơng rút dịch nuơi cấy ra ngồi cho đến khi kết thúc quá trình lên men. Đối với lên men theo kiểu liên tục, nguồn dinh dưỡng được bổ sung liên tục trong quá trình lên men và dịch lên men cũng được chiết ra liên tục, cân bằng với tốc độ bổ sung nguồn dinh dưỡng một khi thể tích dịch lên men đạt đến mức tới hạn (Hình 1.13). Do các qui trình lên men sản xuất các sản phẩm protein tái tổ hợp thường là dạng hiếu khí cĩ kiểm sốt, nên cần thiết phải cung cấp oxygen trong quá trình nuơi cấy, ngồi ra trong một vài trường hợp cần bổ sung thêm chất phá bọt và đơi khi cĩ cả acid hoặc base để hiệu chỉnh pH [61].
Hình 1.13. Mơ hình biểu diễn sự động học của nồng độ tế bào và của cơ chất trong quá trình nuơi cấy theo thời gian của các phương pháp lên men. (a) Phương pháp mẻ, (b) Phương pháp mẻ-bổ sung, (c) Phương pháp liên tục.
1.6.2. Đặc điểm lên men mẻ
Trong phương pháp lên men mẻ (batch culture) thì tồn bộ những biến đổi trong nồi lên men như thành phần mơi trường nuơi cấy, nồng độ tế bào vi sinh vật, hàm lượng của các chất trao đổi… là kết quả của quá trình tăng trưởng tế
Luận án Tiến sĩ Tổng quan
bào, của sự trao đổi chất trong nội bào [61]. Quá trình lên men mẻ diễn ra qua 4 giai đoạn (Hình 1.14).
Giai đoạn đầu tiên là ngay sau khi cấy giống vào hệ thống gọi là lag pha (a). Trong giai đoạn này quá trình tăng trưởng hầu như khơng xảy ra, vi sinh vật thích ứng với mơi trường và điều kiện nuơi cấy mới. Khi nuơi cấy vi sinh vật với qui mơ sản xuất cần phải giảm thiểu giai đoạn này. Trong giai đoạn tiếp theo (log pha) (b), vi sinh vật bắt đầu tăng trưởng nhanh dần và đạt tốc độ cao nhất sau đĩ chậm dần. Ở giai đoạn ổn định (stationary phase) (c), mật độ tế bào hầu như khơng thay đổi do sự giới hạn của một số cơ chất dinh dưỡng trong mơi trường nuơi cấy và sau đĩ quá trình nuơi cấy đi vào pha suy vong (death phase) (d) khi mà mơi trường nuơi cấy trở nên bất lợi như nguồn dinh dưỡng cạn kiệt, một số chất gây ức chế được sinh ra bởi chính vi sinh vật trong các pha trước đĩ.
0 0.2 0.4 0.6 0.8 0 10 20 30 40
Thời gian nuơi cấy (giờ)
Ln (
nồng độ t
ế ba
øo)
Hình 1.14. Động học tăng trưởng của vi sinh vật trong lên men mẻ.
Sự biến đổi mật độ tế bào trong log pha cĩ thể được biểu diễn theo phương trình dx/dt = μ.x (1), trong đĩ x là mật độ tế bào vi sinh vật; t là thời gian lên men (giờ) và μ là tốc độ tăng trưởng đặc trưng, giờ-1. Từ phương trình trên, ta
Luận án Tiến sĩ Tổng quan cĩ: dx/x = μdt Ỉ ∫t = ∫ to t to dt x dx/ μ Ỉ (lnxt- lnxo) = μ(t-to) (2). Trong đĩ xo là lượngsinh khối ban đầu (to) xt: lượng sinh khối sau thời gian nuơi cấy t (giờ).
Mơi trường nuơi trong pha log rất giàu dinh dưỡng, các điều kiện nuơi cấy tối ưu, do vậy vi sinh vật cĩ thể tăng trưởng với tốc độ tối đa, μmax. Sự phụ thuộc
của mật độ vi sinh vật (x) vào cơ chất dinh dưỡng cĩ thể biểu diễn qua phương
trình: x = Yb/s(si - sr) (3). Trong đĩ Yb/s là hiệu suất chuyển đổi cơ chất thành sinh khối (g/g), si, sr lần lượt là nồng độ cơ chất ban đầu và cịn lại sau thời gian nuơi cấy t (giờ). Phương trình trên cĩ thể dùng để dự đốn được nồng độ tế bào thơng
qua lượng cơ chất sử dụng và hiệu suất tổng hợp sinh khối (Yb/s). Sự phụ thuộc
của tốc độ tăng trưởng vào nồng độ cơ chất giới hạn trong mơi trường nuơi cấy cĩ thể mơ tả theo phương trình Monod như sau: μ=μmax .sr/(Ks+ sr) (4). Trong đĩ
Ks là hằng số sử dụng cơ chất. Đối với một cơ chất nhất định thì mỗi chủng vi
sinh vật cĩ Ks khác nhau. Trong pha ổn định tốc độ tăng trưởng μ Ỉ 0, khi đĩ
các hoạt động trao đổi chất trong tế bào vi sinh vật tiếp tục diễn ra với tốc độ cao, đặc biệt là các chất trao đổi thứ cấp (khơng xảy ra trong pha tăng trưởng). Theo Pirt (1975) [61] thì động học của sự hình thành sản phẩm trao đổi chất của vi sinh vật trong quá trình nuơi cấy được phân biệt ra thành hai dạng: các sản phẩm phụ thuộc tăng trưởng (sản phẩm biến dưỡng sơ cấp) và các sản phẩm khơng phụ thuộc tăng trưởng (sản phẩm biến dưỡng thứ cấp). Sự hình thành các
sản phẩm biến dưỡng sơ cấp cĩ thể được mơ tả theo phương trình: dp/dt = qp.x
(5). Trong đĩ p là nồng độ sản phẩm, qp là tốc độ tạo sản phẩm đặc trưng (mg
sản phẩm/g sinh khối/giờ). Mặt khác, sự hình thành sản phẩm liên quan đến sinh khối tế bào theo phương trình: dp/dx = Yp/x (6). Trong đĩ Yp/x là hiệu suất sản phẩm theo sinh khối tế bào (g sản phẩm/ g sinh khối). Từ hai phương trình trên ta cĩ: (dp/dt)/(dp/dx) = qp.x/Yp/x Ỉ dx/dt = qp.x/Yp/x (7), mà dx/dt = μ.x.
Luận án Tiến sĩ Tổng quan
Do vậy μ.x = qp.x/Yp/x Ỉ qp = μ.Yp/x (8)
Như vậy, tốc độ tạo sản phẩm đặc trưng phụ thuộc vào tốc độ tăng trưởng đặc trưng của chủng trong quá trình nuơi cấy [61].
1.6.3. Đặc điểm lên men liên tục
Pha tăng trưởng trong nuơi cấy dạng mẻ cĩ thể được tiếp tục duy trì bằng cách bổ sung thêm mơi trường dinh dưỡng vào nồi lên men. Thơng thường mơi trường bổ sung này cĩ chứa cơ chất giới hạn. Trong quá trình lên men, nếu khơng cĩ sự ảnh hưởng của các chất ức chế thì sự tăng trưởng của chủng được duy trì đến khi cơ chất dinh dưỡng trong mơi trường cạn kiệt. Cơ chất dinh dưỡng được bổ sung liên tục cho đến khi nồi lên men đạt thể tích giới hạn. Khi đĩ, bắt đầu thực hiện việc chiết dịch lên men ra khỏi nồi theo tốc độ cân bằng với lưu lượng nạp cơ chất dinh dưỡng và thể tích dịch lên men trong nồi được duy trì ở mức giới hạn. Phương pháp lên men này gọi là lên men liên tục (continuous culture). Sự biến động thể tích dịch lên men do việc nạp mơi trường dinh dưỡng
vào được xác định bởi độ pha lỗng D: D = F/V (9). Trong đĩ F là lưu tốc nạp
liệu (dm3/hr), V là thể tích (dm3). Tổng sự biến đổi nồng độ tế bào trong một
khoảng thời gian nhất định của quá trình nuơi cấy cĩ thể được biểu diễn:
dx/dt = tăng trưởng – chiết suất hay dx/dt = μ.x - D.x (10)
Trong điều kiện ổn định, hệ thống cân bằng, nồng độ tế bào trong nồi lên men khơng thay đổi, lúc đĩ dx/dt = 0, từ đĩ μ = D. Như vậy, đối với phương pháp
lên men liên tục, chúng ta cĩ thể dùng độ pha lỗng D (hay tốc độ bổ sung dinh
dưỡng F) để kiểm sốt tốc độ tăng trưởng đặc trưng μ của chủng nuơi cấy.
1.6.4. Đặc điểm lên men mẻ-bổ sung
Năm 1973, Yoshida và cộng sự [61] đã giới thiệu một dạng lên men khác gọi là fed-batch, lên men mẻ-bổ sung: nuơi cấy theo dạng mẻ cĩ bổ sung dinh
Luận án Tiến sĩ Tổng quan
dưỡng liên tục nhưng khơng chiết xuất dịch nuơi cấy. Chất dinh dưỡng được nạp vào hệ thống trong kiểu lên men này theo một số phương án sau: (i) Dịch bổ sung hồn tồn giống như mơi trường dinh dưỡng ban đầu; (ii) Dịch bổ sung cĩ chứa cơ chất giới hạn với nồng độ giống như nồng độ của cơ chất này trong mơi trường ban đầu; (iii) Dịch bổ sung chứa cơ chất giới hạn với nồng độ đậm đặc; (iv) Dịch bổ sung chứa cơ chất giới hạn với nồng độ rất đậm đặc, làm tăng khơng đáng kể thể tích dịch lên men. Hệ thống lên men mẻ-bổ sung theo (i) và (ii) làm thay đổi thể tích dịch lên men trong quá trình nuơi cấy, gọi là hệ thống lên men mẻ-bổ sung thay đổi thể tích. Theo phương án (iii), (iv), khơng làm thay đổi đáng kể thể tích dịch lên men nên được gọi là hệ thống lên men mẻ-bổ sung khơng thay đổi thể tích.
- Lên men mẻ-bổ sung thay đổi thể tích
Xét quá trình lên men theo phương pháp mẻ trong đĩ sự tăng trưởng bị giới hạn bởi nồng độ của một cơ chất dinh dưỡng, nồng độ sinh khối được biểu thị bằng phương trình: xt = xo + Y(si-sr) (11). Trong đĩ xt là nồng độ sinh khối sau thời gian nuơi cấy t giờ, xo là nồng độ tế bào tại thời điểm nạp giống vào, si, sr là nồng độ cơ chất giới hạn trong mơi trường ban đầu và cịn lại trong quá trình nuơi cấy. Giả sử xo là rất nhỏ, khi sr = 0 thì: xt = xmax = Y.si (12). Nếu tại thời điểm sr = 0, mơi trường dinh dưỡng được nạp vào với tốc độ pha lỗng D < μmax
thì khi đĩ hầu như tồn bộ chất dinh dưỡng đưa vào đều bị sử dụng hết và như vậy: F.si= μ.(X/Y) (13). Trong đĩ F là tốc độ nạp liệu, X là tổng sinh khối trong dịch nuơi cấy, X = x.V với V là thể tích dịch nuơi cấy tại thời điểm t. Từ phương trình trên, cĩ thể thấy lượng cơ chất dinh dưỡng đưa vào hệ thống được vi sinh
vật sử dụng hết ngay lập tức và do vậy ds/dt = 0. Mặc dù tổng lượng sinh khối X
tăng lên theo thời gian nhưng nồng độ tế bào x khơng thay đổi, dx/dt = 0 nên μ = D. Khi thể tích dịch lên men tăng lên, D giảm xuống: D = F/(Vo+Ft) (14), Vo là
Luận án Tiến sĩ Tổng quan
thể tích dịch lên men ban đầu. Năm 1979, Pirt [61] đã mơ tả sự biến động của nồng độ cơ chất của kiểu lên men này trong quá trình nuơi cấy theo phương trình: dp/dt=qp.x - Dp (15).
Phương án bổ sung dinh dưỡng vào trong hệ thống kiểu này cần phải được tối ưu hĩa theo mối quan hệ của qp và μ (D).
- Lên men mẻ-bổ sung cố định thể tích
Xét quá trình lên men khi mơi trường dinh dưỡng ban đầu cạn kiệt, cơ chất giới hạn với nồng độ đậm đặc được nạp vào hệ thống nhưng khơng làm thay đổi thể tích dịch lên men: dx/dt = GY, nhưng dx/dt = μ.x.
Do đĩ: μ = GY/x (16). Trong đĩ G là tốc độ bổ sung cơ chất dinh dưỡng
(g/dm3/hr), Y là hiệu suất. Nếu GY/x < μmax thì cơ chất giới hạn sẽ được sử dụng ngay khi vừa được bổ sung vào nồi lên men và ds/dt=0, tuy nhiên dx/dt ≠ 0 bởi vì nồng độ và lượng tế bào trong nồi lên men sẽ tăng lên theo thời gian. Sự thay đổi nồng độ tế bào trong quá trình nuơi cấy theo kiểu lên men này cĩ thể được mơ tả theo phương trình: xt= xo + GYt (17).
Sự biến đổi nồng độ sản phẩm trong cũng cĩ thể được biểu diễn bằng phương trình: dp/dt = qp.x = qp(xo+ GYt) (18).
1.6.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến lên men mẻ-bổ sung chủng E. coli để sản xuất protein tái tổ hợp sản xuất protein tái tổ hợp
Cĩ nhiều yếu tố ảnh hưởng lên sự tổng hợp protein đặc trưng từ tế bào E.
coli tái tổ hợp: sự tương tác giữa vector và tế bào chủ, tính ổn định của plasmid,
hiệu quả cảm ứng của hệ thống promotor, tính ổn định của protein, nồng độ sinh khối… [59]. Mục tiêu quan trọng của quá trình lên men là tăng cường tối đa hiệu suất tạo sản phẩm theo thể tích lên men, tức là trong thời gian ngắn nhất, lượng sản phẩm thu được trong một đơn vị thể tích là cao nhất. Do vậy, nuơi cấy tế bào
Luận án Tiến sĩ Tổng quan
mật độ cao là phương án rất quan trọng để hướng đến mục tiêu trên. Nĩi chung, trong sản xuất protein tái tổ hợp bởi E. coli thì khi mật độ tế bào càng cao, lượng
protein được sản xuất càng lớn. Việc nuơi cấy E. coli đạt mật độ cao đã được
nghiên cứu nhiều từ những năm 1970, chủ yếu tập trung vào việc cải tiến các kỹ thuật, phương pháp nuơi cấy, tối ưu hĩa thành phần mơi trường. Hiện nay, người
ta đã thành cơng trong việc nuơi cấy E. coli mật độ cao cĩ thể đạt đến 190 g sinh
khối khơ/ L mơi trường [58]. Do hầu hết các protein mục tiêu là sản phẩm nội
bào được tích lũy bên trong tế bào E. coli tái tổ hợp nên lượng sản phẩm thu
được tỷ lệ thuận với nồng độ tế bào và hiệu suất sản xuất đặc trưng của chủng.
Kỹ thuật nuơi cấy E. coli tái tổ hợp mật độ cao đã được phát triển nhằm mục
đích cải thiện sản lượng và cĩ nhiều ưu điểm như làm giảm thể tích dịch nuơi cấy, tăng hiệu quả cho các qui trình thu hồi, giảm chi phí đầu tư, chi phí [75].