a. Cắt loại 6xHis bằng CNBr
Protein dung hợp 6xHis-MPI được xử lý bằng CNBr để loại bỏ 6xHis thu
nhận MPI. Kết quả xử lý được trình bày trên Bảng 3.5.
Bảng 3.5. Kết quả thu nhận MPI khi xử lý 6xHis-MPI bằng CNBr
Phân đoạn Thể tích,
ml protein, mg/ml Nồng độ tổng, mg Protein
Dịch 6xHis-MPI trước khi tủa với Zn2+ 500 0,36 180
Dịch 6xHis-MPI trong đệm sau tủa 80 2,22 177,6
Dịch 6xHis-MPI sau phản ứng cắt 15 5,74 86,1
Để kiểm chứng kết quả phản ứng cắt loại 6xHis từ 6xHis-MPI, chúng tơi tiến hành phân tích bằng phương pháp điện di SDS-PAGE và kiểm tra bằng phương pháp lai Western Blot với kháng thể kháng insulin và kháng thể kháng Histidine. Kết quả được trình bày trên Hình 3.22.
Luận án Tiến sĩ Kết quả –Biện luận
Hình 3.22. Kết quả kiểm tra phản ứng phân cắt 6xHis-MPI bằng CNBr.
A, SDS-PAGE; B, Western Blot với kháng thể kháng 6xHis; C, Western-Blot với kháng thể kháng insulin. Giếng 1, Thang protein; 2, Dịch 6xHis-MPI trước xử lý; 3, Dịch protein sau xử lý bằng CNBr.
Kết quả SDS-PAGE ở Hình 3.22 A cho thấy ở giếng 3 cĩ xuất hiện một
vạch protein cĩ kích thước khoảng 9 kDa, tương ứng với vạch protein xuất hiện trong giếng 2, được nhận diện là 6xHis-MPI. Ngồi ra, ở giếng 3 cịn xuất hiện một vạch protein cĩ kích thước nhỏ hơn với kích thước khoảng 7 kDa, nằm ngay dưới vạch 6xHis-MPI. Đây là protein được dự đốn là MPI sau đã cắt rời thẻ 6xHis. Kết quả xác nhận bằng phương pháp Western Blot với kháng thể kháng
6xHis trên Hình 3.22 B cho thấy ở giếng 3 cĩ vạch protein tương ứng như trong
giếng 2, đây chính là 6xHis-MPI cịn lại do phản ứng cắt loại thẻ 6xHis khơng triệt để. Mặt khác khơng cĩ sự xuất hiện của vạch tín hiệu protein bên dưới vạch
6xHis-MPI như trong kết quả điện di ở giếng 3. Hình 3.22 C (kết quả kiểm tra
bằng Western Blot với kháng thể kháng insulin) cho thấy ở giếng 3 cĩ hai vạch tương ứng như trong kết quả điện di SDS-PAGE, protein trong các vạch này được
Luận án Tiến sĩ Kết quả –Biện luận
xác nhận là cĩ chứa cấu trúc của insulin nên cĩ tín hiệu khi lai với kháng thể kháng insulin.
Từ các kết quả thu được, chúng tơi cĩ thể khẳng định rằng khi dùng CNBr cĩ thể cắt loại được thẻ 6xHis ra khỏi cấu trúc protein dung hợp 6xHis- MPI. Tuy nhiên, hiệu quả cắt chưa cao, trong dịch protein sau phản ứng cịn chứa 6xHis-MPI.
b. Tinh chế thu nhận MPI
Dịch protein thu được sau phản ứng cắt ở trên đây được cho qua cột Ni- NTA để thu nhận MPI bằng hệ thống FPLC. Các bước thao tác đã được mơ tả trong phần mục 2.4.14. Kết quả được trình bày trên Bảng 3.6.
Bảng 3.6. Kết quả tinh chế thu nhận MPI từ dịch xử lý bằng CNBr
Phân đoạn Thể tích,
ml protein, mg/ml Nồng độ, tổng, mg Protein
Dịch protein trước tinh chế 15 5,74 86,1
Dịch MPI sau tinh chế 44 0,83 36,53
Dịch 6xHis-MPI và thẻ 6xHis 120 0,09 10,8
Để đánh giá kết quả tinh chế MPI, chúng tơi tiến hành phân tích dịch protein bằng phương pháp điện di SDS-PAGE và xác nhận lại bằng phương pháp
lai Western Blot với kháng thể kháng insulin. Kết quả thu nhận được trên Hình
3.23 cho thấy ở giếng 3 cĩ một vạch protein cĩ kích thước khoảng 9 kDa, tương
ứng với vạch protein được nhận diện là MPI trong dịch phân cắt trước khi qua cột (giếng 2). Như vậy dịch protein trong phân đoạn này được xác định là MPI đã được tinh sạch từ hỗn hợp dịch sau phản ứng phân cắt. Ở giếng 4 cĩ xuất hiện một vạch protein cĩ kích thước khoảng 9 kDa, được xác định là 6xHis-MPI cịn
Luận án Tiến sĩ Kết quả –Biện luận
lại do phản ứng cắt khơng triệt để. Kết quả lai bằng Western Blot với kháng thể kháng insulin (Hình 3.23, B) đã xác nhận lại kết quả trên.
Như vậy, từ 180 mg 6xHis-MPI chúng tơi đã thành cơng trong việc cắt
loại thẻ 6xHis và tinh chế để thu được 36,53 mg MPI, đạt hiệu suất 20,29%.
Kết quả cắt loại thẻ 6xHis bằng CNBr và tinh chế thu nhận MPI, đặc biệt là giai đoạn cắt loại thẻ 6xHis, đạt hiệu suất tương đối thấp, cịn một lượng lớn 6xHis-MPI sau phản ứng. Nguyên nhân cĩ thể là do điều kiện của phản ứng cắt bằng CNBr chưa tối ưu. Cần phải mở rộng khảo sát nồng độ CNBr, nhiệt độ, thời gian phù hợp để phản ứng diễn ra triệt để.
Hình 3.23. Kết quả tinh chế MPI từ dịch phân cắt 6xHis-MPI bằng CNBr.
A, SDS-PAGE; B, Western Blot với kháng thể kháng insulin. Giếng 1, Thang protein; 2, Protein sau khi xử lý; 3, Phân đoạn protein chứa MPI; 4, Phân đoạn chứa 6xHis-MPI sau khi dung ly ra khỏi cột Ni- NTA.
Luận án Tiến sĩ Kết quả –Biện luận 3.4.Thu nhận insulin từ MPI
3.4.1. Tái gấp cuộn MPI
Sản phẩm MPI thu được ở phần trên là dạng biến tính, cần được tái gấp cuộn để cĩ cấu hình tự nhiên trước khi được xử lý bằng Trypsin/Carboxy- peptidase B để thu nhận insulin. Các bước thực hiện tái gấp cuộn MPI được mơ
tả trong phần mục 2.4.15. Kết quả tái gấp cuộn MPI được kiểm tra bằng phương
pháp ELISA gián tiếp. Sản phẩm tái gấp cuộn được cố định trên đĩa ELISA và được phát hiện bằng kháng thể đơn dịng OXI-005 nhận diện epitope lập thể của
MPI. Kết quả ELISA được trình bày trên Hình 3.24 và Bảng 3.7.
Hình 3.24. Kết quả ELISA xác nhận cấu hình tái gấp cuộn của MPI.
Giếng 1, Insulin chuẩn; 2, Mẫu trắng (PBS); 3, Mẫu trắng (HCl); 4, MPI tái gấp cuộn (rMPI); 5, 6xHis-MPI; 6, MPI chưa tái gấp cuộn. Bảng 3.7. Kết quả ELISA kiểm tra cấu hình tái gấp cuộn MPI theo OD492nm
Giếng Mẫu A B Trung bình
1 Insulin chuẩn 3,764 3,802 3,783
2 Mẫu trắng PBS 0,202 0,215 0,206
3 Mẫu trắng HCl 0,198 0,187 0,193
4 MPI tái gấp cuộn 1,934 1,916 1,925
5 6xHis-MPI 0,256 0,239 0,248
6 MPI chưa tái gấp cuộn 0,201 0,224 0,213
A B
Luận án Tiến sĩ Kết quả –Biện luận
Các kết quả trên cho thấy ở cặp giếng 4 (MPI tái gấp cuộn) cĩ xuất hiện tín hiệu màu dương tính OD = 1,925, tương tự như ở cặp giếng 1 (insulin chuẩn) trong khi 6xHis-MPI (giếng 5) và MPI chưa được tái gấp cuộn (giếng 6) cho tín hiệu màu âm tính (giá trị OD rất thấp, tương đương với OD của các mẫu trắng). Từ đĩ, chúng tơi cĩ thể khẳng định rằng đã tái gấp cuộn thành cơng MPI dạng cấu hình tự nhiên.
Tuy nhiên hiệu quả tái gấp cuộn phụ thuộc vào độ pH của dung dịch tái gấp cuộn. Đối với trường hợp của proinsulin quá trình tái gấp cuộn thường được tiến hành ở pH 10,5 (Joakim Nilsson, 1996)[49]. Trong trường hợp của mini- proinsulin, theo Chang (1998) [16] thì pH tối ưu cho quá trình tái gấp cuộn là 11,5. Để kiểm tra lại điều kiện pH tái gấp cuộn tối ưu trong nghiên cứu này, chúng tơi tiến hành khảo sát hiệu quả tái gấp cuộn của MPI khi thay đổi pH của dung dịch tái gấp cuộn là 10,6 và 11,5. Kết quả đánh giá hiệu quả tái gấp cuộn
theo pH bằng phản ứng ELISA được ghi nhận trên Hình 3.25và Bảng 3.8. Kết quả
trên Hình 3.25cho thấy ở cặp giếng số 3, 4 (pH dung dịch tái gấp cuộn tương ứng
là 11,5 và 10,6) cĩ xuất hiện tín hiệu dương đậm hơn so với tín hiệu ở cặp giếng số 2 (insulin chuẩn) và cao hơn nhiều so với giếng thử khơng (giếng 1). Trong khi đĩ, ở cặp giếng số 7 (dịch MPI biến tính bởi nhiệt) thì cho tín hiệu âm. Như vậy, hiệu quả tái gấp cuộn khơng bị ảnh hưởng bởi điều kiện pH trong khoảng từ 10,6 đến 11,5.
Từ các kết quả trên chúng tơi kết luận rằng đã tái gấp cuộn thành cơng MPI từ dịch MPI dạng biến tính. Và ở trị pH 10,6 hay 11,5 thì hiệu quả tái gấp cuộn là tương đương nhau. Chúng tơi chọn pH 11,5 làm cơ sở cho việc thực hiện các thí nghiệm tiếp theo.
Luận án Tiến sĩ Kết quả –Biện luận
Hình 3.25. Kết quả ELISA khảo sát pH dung dịch tái gấp cuộn.
A, B là hai giếng của mỗi một mẫu thử. Dãy 1, Mẫu thử khơng; 2, Dịch insulin chuẩn; 3, Dịch MPI tái gấp cuộn với pH 11,5; 4, dịch MPI tái gấp cuộn với pH 10,6; 5, Dịch insulin tái gấp cuộn ở pH 11,5; 6, Dịch insulin tái gấp cuộn ở pH 10,6; 7, Dịch MPI chưa tái gấp cuộn.
Bảng 3.8. Kết quả ghi nhận giá trị OD492nm của phản ứng ELISA khảo sát pH của dung dịch tái gấp cuộn.
Giếng Mẫu A B Trung bình
1 Thử khơng 0,153 0,122 0,138
2 Insulin chuẩn 3,586 3,708 3,647
3 MPI tái gấp cuộn ở pH 11,5 6,000 6,000 6,000
4 MPI tái gấp cuộn ở pH 10,6 6,000 6,000 6,000
5 Insulin tái gấp cuộn ở pH 11,5 1,347 1,297 1,322
6 Insulin tái gấp cuộn ở pH 10,6 1,132 0,924 1,028
7 MPI chưa tái gấp cuộn 0,201 0,224 0,213
Sử dụng các điều kiện tái gấp cuộn nêu trên chúng tơi thực hiện phản ứng tái gấp cuộn cho 40,62 mg MPI trong tổng dung tích 92,4 ml. Kết quả thu hồi MPI tái gấp cuộn được trình bày trên Bảng 3.9.
Luận án Tiến sĩ Kết quả –Biện luận
Bảng 3.9. Kết quả tái gấp cuộn MPI tạo cấu hình MPI tự nhiên
Thể tích dịch MPI biến tính trước gấp cuộn, ml 20
Hàm lượng 6xHis-MPI trong dịch MPI trước gấp cuộn, mg/ml 2,31
Thể tích dịch tái gấp cuộn, ml 92,4
Nồng độ 6xHis-MPI tái gấp cuộn, mg/ml 0,5
MPI thu được từ phản ứng tái gấp cuộn được phân tích bằng sắc ký RP-
HPLC. Kết quả phân tích (Hình 3.26) cho thấy ở trường hợp mẫu chuẩn insulin cĩ
hoạt tính (1), cĩ sự xuất hiện một peak duy nhất khoảng 650 mAU ở vị trí khoảng 29,5 phút. Trong khi đĩ, ở mẫu insulin đã làm biến tính bằng nhiệt (2) thì khơng thấy cĩ xuất hiện peak ở vị trí tương ứng này nữa. Điều đĩ chứng tỏ rằng điều kiện sắc ký bằng cột C18 sử dụng trong hệ thống RP-HPLC này cĩ thể phân biệt cấu hình insulin tự nhiên (cĩ hoạt tính) và cấu hình khơng tự nhiên (bị biến tính bằng nhiệt). Ở mẫu MPI trước khi tái gấp cuộn (3), chúng tơi nhận thấy cĩ xuất hiện peak tín hiệu duy nhất vào khoảng phút thứ 3. Điều này được giải thích là do MPI chưa cĩ cấu hình tái gấp cuộn nên khơng thể tương tác được với cột và thốt ra khỏi hệ thống ngay sau khi nạp mẫu khoảng 3 phút. Trong trường hợp của MPI đã tái gấp cuộn (4), cĩ một peak tín hiệu duy nhất khoảng 2000 mAU ở khoảng phút thứ 33, gần với peak của insulin cĩ hoạt tính. Cĩ thể suy luận rằng MPI tái gấp cuộn cĩ cấu hình tự nhiên. Do MPI vẫn cịn đoạn C trong cấu trúc phân tử nên thời gian lưu giữ trong cột cao hơn so với trường hợp của insulin (khoảng 4 phút). Kết quả đánh giá hiệu suất tái gấp cuộn được trình bày theo Bảng 3.10.
Luận án Tiến sĩ Kết quả –Biện luận min 0 10 20 30 40 50 60 mAU 0 250 500 750 1000 1250 1500 1750 *VWD1 A, Wavelength=215 nm (INSULIN\091707H1.D) *VWD1 A, Wavelength=215 nm (INSULIN\090711H2.D) *VWD1 A, Wavelength=215 nm (INSULIN\090711H3.D) *VWD1 A, Wavelength=215 nm (INSULIN\090711I2.D)
Hình 3.26. Kết quả phân tích dung dịch MPI tái gấp cuộn bằng RP-HPLC. (1) Mẫu insulin chuẩn cĩ hoạt tính, (2) Mẫu insulin biến tính bằng nhiệt, (3) Mẫu MPI chưa tái gấp cuộn, (4) Mẫu MPI sau khi tái gấp cuộn.
Bảng 3.10. Kết quả phân tích MPI tái gấp cuộn bằng RP- HPLC
Lượng nạp Nồng độ protein Lượng protein Diện tích peak
Mẫu insulin chuẩn (A) 20μl 0,5 mg/ml 10μg 7.593
Mẫu MPI tái gấp cuộn (B) 20μl 1,05 mg/ml 21μg 68.857
Từ kết quả ghi nhận được, chúng tơi đánh giá hàm lượng MPI (MPItgc) cĩ trong dung dịch sau tái gấp cuộn là:
MPItgc = dt (B)/dt (A) * 10 = 68.857/7.3593 * 10 = 9,0685 μg
So sánh với lượng mẫu nạp vào (21 μg), hiệu suất tái gấp cuộn (HStgc) là:
HStgc = 9,0685 / 21* 100 = 43,18%
2 1
3 4
Luận án Tiến sĩ Kết quả –Biện luận
Từ các kết quả thu nhận được, cĩ thể khẳng định rằng chúng tơi đã thành cơng trong việc tái gấp cuộn MPI dạng cấu hình tự nhiên với hiệu suất đạt 43,18%. So với hiệu suất tái gấp cuộn được báo cáo bởi Chang SG và cộng sự (1998) [16] thì kết quả thu được thấp hơn. Điều này cĩ thể giải thích là điều kiện thí nghiệm chưa tối thích đặc biệt là phải khống chế nồng độ protein trong quá trình tái gấp cuộn.
Chúng tơi sử dụng MPI tái gấp cuộn này cho các thí nghiệm nghiên cứu cắt loại đoạn peptide C để thu nhận insulin.
3.4.2. Cắt loại peptide C bằng trypsin
Mẫu mini-proinsulin tái gấp cuộn thu được ở phần trên được tiến hành xử lý cắt loại đoạn peptide C bằng trypsin theo phương pháp được mơ tả trong mục
2.4.17. Dung dịch sau phản ứng thủy phân được kiểm tra bằng phương pháp điện di SDS-PAGE và đánh giá cấu hình tự nhiên của insulin tái tổ hợp bằng phương pháp RP-HPLC. Kết quả kiểm tra phản ứng cắt loại peptide C ra khỏi cấu trúc MPI tái gấp cuộn bằng phương pháp điện di SDS-PAGE được ghi nhận trên Hình
3.27. Ở giếng 4, mẫu dung dịch MPI sau khi cắt loại đoạn peptide C cĩ xuất hiện
vạch protein đậm cĩ kích thước khoảng 5,8 kDa tương ứng với vạch insulin chuẩn (giếng 2). Như vậy trong dung dịch sau phản ứng cắt cĩ chứa insulin, được hình thành từ việc cắt loại đoạn peptide C ra khỏi cấu trúc MPI tái gấp cuộn. Mặt khác, trong giếng 4 cịn xuất hiện một vạch protein nhạt hơn cĩ kích thước tương ứng với MPI trong giếng 3. Cĩ thể đây là MPI tái gấp cuộn cịn lại trong dung dịch sau phản ứng mà nguyên nhân là phản ứng cắt loại peptide C khơng đạt hiệu quả tối ưu.
Từ kết quả thu được cĩ thể khẳng định rằng đã cắt loại được peptide C ra khỏi MPI tái gấp cuộn.
Luận án Tiến sĩ Kết quả –Biện luận
Hình 3.27. Kết quả kiểm tra sự cắt loại petide C bằng điện di SDS-PAGE.
Giếng 1, thang protein; 2, Iinsulin chuẩn; 3, MPI tái gấp cuộn trước khi cắt; 4, Dịch MPI tái gấp cuộn sau khi cắt bằng trypsin.
Kết quả kiểm tra cấu hình insulin tái tổ hợp thu nhận được bằng sắc ký
ngược pha RP-HPLC được trình bày trên Hình 3.28. Kết quả cho thấy khoảng
phút thứ 29,5 cĩ xuất hiện một peak khoảng 600 mAU tương ứng với thời gian lưu giữ của insulin chuẩn trên cột (Hình 3.26).
Kết quả này cho phép khẳng định rằng insulin tái tổ hợp thu nhận được cĩ cấu hình tự nhiên.
14,4 20,1
Luận án Tiến sĩ Kết quả –Biện luận m 0 10 20 30 40 50 60 mAU -100 0 100 200 300 400 500 VWD1 A, Wavelength=215 nm (INSULIN\090827H1.D)
Hình 3.28. Kết quả phân tích dịch cắt loại đoạn peptide C bằng trypsin theo phương pháp RP-HPLC.
3.5.Kiểm tra hoạt tính của insulin tái tổ hợp trên chuột
Dung dịch insulin tái tổ hợp thu nhận được sau khi xử lý bằng trypsin được tiến hành kiểm tra hoạt tính sơ bộ bằng cách tiêm vào chuột được xử lý cĩ hàm lượng đường trong máu cao. Tiến hành thí nghiệm theo phương pháp trong mục
2.4.22. Kết quả ghi nhận được trình bày trên Bảng 5.3 (Phụ lục). Xử lý tính tốn
số liệu theo phương pháp như đã trình bày trong mục 2.4.22, kết quả đánh giá
được trình bày trong Bảng 3.11 và Hình 3.29.
Kết quả cho thấy, các mẫu insulin tái tổ hợp thu được (A, B) sau khi cắt loại đoạn peptide C cĩ hoạt tính làm giảm đường huyết chuột sau khi tiêm 30 phút và 60 phút. Tuy nhiên so với insulin chuẩn thì hoạt tính của các mẫu insulin tái tổ hợp thu được thấp hơn tính trên cùng một lượng protein insulin tiêm vào chuột. Nguyên nhân cĩ thể là do độ tinh sạch của insulin tái tổ hợp thu được chưa cao, điều kiện thí nghiệm chưa được tối ưu nên hoạt tính cịn thấp.
Luận án Tiến sĩ Kết quả –Biện luận
Bảng 3.11. Kết quả đánh giá hoạt tính insulin tái tổ hợp trên chuột
Mức biến động hàm lượng đường trong máu chuột sau tiêm (mg/dl)
Chuột mẫu
0 phút 30 phút 60 phút
1. Chứng dương (insulin chuẩn) 0 154 109
2. Mẫu Insulin A 0 67 28 3. Mẫu Insulin B 0 53 28 -200 -150 -100 -50 0 0 30 60
Thời gian sau khi tiêm (phút)
Đ ộ biế n độ ng ha øm lượ