Đoạn gen mpi được tổng hợp bằng phương pháp PCR tái tổ hợp 2 bước
với các cặp mồi Ins1F/Ins2R và Ins3F/Ins4R và sử dụng enzyme Pfu DNA
polymerase. Sản phẩm PCR cĩ kích thước theo tính tốn khoảng 250 bp được
phân tích trên gel agarose 1,5%. Kết quả thu được trên Hình 3.1. cho thấy sản
phẩm PCR cĩ kích thước khoảng 250 bp như thiết kế (giếng 2). Sản phẩm này được tinh chế và được dịng hĩa vào plasmid pBlue.
Hình 3.1. Kết quả phân tích gen mpi tổng hợp bằng PCR tái tổ hợp trên gel agarose.
Luận án Tiến sĩ Kết quả –Biện luận 3.1.2. Tạo dịng gen mpi vào plasmid pBlue
Gen mpi được tạo dịng vào plasmid pBlue đã mở vịng bằng EcoRV để
tạo plasmid pBIns. Thực hiện điện biến nạp sản phẩm nối trên vào vi khuẩn E.
coli DH5α. Chọn lọc các tế bào đã biến nạp plasmid bằng cách trải các tế bào vi
khuẩn này trên mơi trường LB-Agar cĩ bổ sung ampicillin và X-gal. Sau 14 giờ ủ, chúng tơi thu được hai nhĩm khuẩn lạc màu xanh và màu trắng. Các khuẩn
lạc trắng của thể biến nạp E. coli DH5α cĩ mang pBIns được chọn làm các dịng
dự tuyển cho các bước chọn lọc tiếp theo bằng phương pháp cắt giới hạn và giải trình tự gen.
Sử dụng các enzyme cắt giới hạn là NdeI và XhoI để tiến hành phân cắt,
sản phẩm cắt cho hai vạch cĩ kích thước khoảng 2.961 bp, tương ứng với kích thước plasmid pBlue và 250 bp, tương ứng với kích thước của gen mpi (Hình 3.2).
Hình 3.2. Kết quả chọn lọc dịng vi khuẩn E. coli DH5α mang pBIns bằng phương pháp cắt giới hạn.
Luận án Tiến sĩ Kết quả –Biện luận
Như vậy, chúng tơi đã thành cơng trong việc tạo plasmid tái tổ hợp pBIns
mang gen mpi từ plasmid pBlue. Plasmid pBIns được giải trình tự với cặp mồi
T3/T7 để phân tích trình tự của gen mpi được chèn vào. Kết quả đánh giá mức
độ tương đồng so với trình tự lý thuyết cho thấy trình tự gen mpi chính xác 100%
(Hình 3.3).
Hình 3.3. Kết quả giải trình tự gen mpi từ plasmid pBIns và so sánh mức độ tương đồng với trình tự thiết kế.
Luận án Tiến sĩ Kết quả –Biện luận
Từ các kết quả thu được ở trên cĩ thể khẳng định rằng chúng tơi đã tổng
hợp thành cơng gen mpi bằng phương pháp PCR tái tổ hợp với trình tự chính xác
100% so với thiết kế và đã dịng hĩa gen này vào trong plasmid pBlue tạo
plasmid pBIns. Plasmid pBIns được dùng làm nguồn cung cấp gen mpi trong việc
thiết lập các plasmid biểu hiện về sau của nghiên cứu này.
3.1.3. Tạo dịng tế bào E. coli BL21(DE3)/pET43Ins biểu hiện MPI ở dạng dung hợp 6xHis-MPI dạng dung hợp 6xHis-MPI
3.1.3.1. Cấu trúc plasmid pET43Ins tái tổ hợp biểu hiện 6xHis-MPI
Plasmid biểu hiện pET-43.1a được chọn để tạo dịng gen mpi và biểu hiện
trong E. coli. Sơ đồ qui trình tạo dịng được trình bày ở Hình 3.4.
Plasmid pBIns từ dịng tế bào E. coli DH5α/pBIns được thu nhận và xử lý
bằng NdeI và XhoI. Điện di DNA plasmid trên gel agarose 0,8% để thu nhận
đoạn gen mpi. Sau khi được tinh chế qua cột GFX, gen mpi được chèn vào
plasmid pET-43.1a đã được mở vịng cũng bằng cặp enzyme cắt giới hạn
NdeI/XhoI. Biến nạp hỗn hợp sản phẩm nối vào dịng E. coli DH5α và trải trên
mơi trường LB-Amp, ủ và chọn các khuẩn lạc mọc trên mặt agar làm khuẩn lạc dự tuyển. Tách chiết plasmid từ dịng khuẩn lạc dự tuyển, xử lý với cặp enzyme
NdeI/XhoI, sản phẩm cắt được điện di trên gel agarose để kiểm tra kích thước
của plasmid và đoạn gen mpi và kiểm tra mức độ đồng khung của gen mpi sau
khi dịng hĩa vào plasmid biểu hiện pET-43.1a.
Kết quả điện di cho thấy ở giếng sản phẩm cắt (giếng 2), cĩ hai vạch cĩ
kích thước 5.409bp, tương ứng với kích thước của pET-43.1a/NdeI-XhoI và
250bp, tương ứng với kích thước của gen mpi (Hình 3.5). Kết quả kiểm tra mức
độ đồng khung của gen mpi trên plasmid pET43Ins cho thấy mức độ đồng khung
Luận án Tiến sĩ Kết quả –Biện luận
Hình 3.4. Sơ đồ tái tạo dịng gen mpi từ plasmid pBIns vào plasmid pET-43.1a tạo plasmid tái tổ hợp pET43Ins biểu hiện 6xHis-MPI.
Luận án Tiến sĩ Kết quả –Biện luận
Hình 3.5. Kết quả sàng lọc dịng E. coli DH5α mang plasmid pET43Ins bằng phương pháp cắt giới hạn.
Giếng 1, Thang DNA 1kb; 2, Plasmid pET43Ins cắt bằng NdeI /XhoI; 3, Gen mpi.
Hình 3.6. Kết quả kiểm tra mức độ đồng khung của gen mpi trên plasmid pET43Ins.
Luận án Tiến sĩ Kết quả –Biện luận
Như vậy, chúng tơi đã tái tạo dịng thành cơng gen mpi vào plasmid biểu
hiện pET-43.1a tạo plasmid tái tổ hợp pET43Ins mang gen mpi dung hợp mã hĩa
mini-proinsulin dạng dung hợp với thẻ 6xHis (6xHis-MPI).
3.1.3.2. Tạo dịng E. coli BL21(DE3)/pET43Ins biểu hiện 6xHis-MPI
Plasmid pET43Ins được biến nạp vào tế bào E. coli BL21(DE3) bằng
phương pháp điện biến nạp.Thể biến nạp được sàng lọc bằng cách nuơi cấy trên
mơi trường LB-Amp. Các khuẩn lạc mọc được trên mơi trường này được chọn
làm dịng dự tuyển để kiểm tra sự biểu hiện protein 6xHis-MPI của gen mpi.
Tiến hành thí nghiệm theo các thao tác như ở mục 2.4.3, 2.4.4. Kết quả phân tích
SDS-PAGE (Hình 3.7 A) cho thấy cĩ sự xuất hiện một vạch protein cĩ kích thước
khoảng 9 kDa (giếng 5) khi dịng E. coli BL21(DE3)/pET43Ins được cảm ứng với
IPTG. Đây là dạng protein dung hợp giữa MPI và thẻ 6xHis. Các mẫu đối chứng (giếng 2, 3, 4) khơng xuất hiện vạch protein này. Ở giếng 3, xuất hiện vạch
protein cĩ kích thước khoảng 64 kDa khi dịng E. coli BL21(DE3)/pET-43.1a
được cảm ứng, đây là protein HisTag-NusA được mã hĩa bởi plasmid pET-43.1a, được sử dụng như một chứng dương nhằm xác nhận là plasmid pET-43.1a được
biến nạp vào chủng E. coli BL21(DE3) cũng cĩ thể biểu hiện được các protein
theo trình tự trên plasmid khi được cảm ứng bằng IPTG. Plasmid pET43Ins đã được cắt bỏ vùng gen mã hĩa cho HisTag-NusA trong quá trình cắt nối nên khi cảm ứng chỉ cĩ thể biểu hiện 6xHis-MPI (giếng 5). Kết quả này cho thấy dịng
tế bào E. coli BL21(DE3) cĩ mang pET43Ins cĩ khả năng tổng hợp protein dung
hợp 6xHis-MPI.
Vạch protein trên SDS-PAGE (ở giếng 5) được khẳng định là protein dung hợp 6xHis-MPI bằng phương pháp Western Blot sử dụng kháng thể kháng 6xHis
và kháng thể HUI-001 kháng insulin. Các bước thao tác như đã được trình bày
Luận án Tiến sĩ Kết quả –Biện luận
Trường hợp sử dụng kháng thể kháng 6xHis, bản hiện phim Hình 3.7 B cho thấy
cĩ sự xuất hiện hai vạch: vạch 9 kDa tương ứng với 6xHis-MPI và vạch 64 kDa tương ứng với HisTag-NusA (chứng dương) trên gel của SDS-PAGE. Trường hợp
sử dụng kháng thể kháng insulin (Hình 3.7 C), chỉ xuất hiện một vạch tương ứng
với vạch khoảng 9 kDa là của 6xHis-MPI (giếng 5). Các kết quả này cho phép
kết luận rằng protein cĩ trọng lượng phân tử khoảng 9 kDa biểu hiện từ chủng E.
coli BL21(DE3)/pET43Ins chính là protein dung hợp 6xHis-MPI.
Hình 3.7. Kiểm tra sự biểu hiện của 6xHis-MPI bởi E. coli BL21(DE3)/pET43Ins. A, Kết quả điện di SDS-PAGE; B, Kết quả lai Western-Blot với kháng thể kháng 6xHis; C, Western-Blot với kháng thể HUI-001 kháng insulin. 1, Thang phân tử lượng protein; 2, E. coli BL21 (DE3); 3, E. coli BL21 (DE3)/pET43.1.a/IPTG; 4, E. coli BL21 (DE3)/pET43Ins; 5, E. coli BL21 (DE3)/pET43Ins/IPTG.
3.1.4. Kiểm tra trình tự amino acid của 6xHis-MPI
Mẫu 6xHis-MPI thu nhận ở trên được xử lý bằng CNBr để cắt loại thẻ 6xHis, thu nhận MPI. Tiến hành giải trình tự amino acid của MPI theo phương pháp mơ tả ở phần Phụ lục. Kết quả cho thấy việc thủy phân khơng hồn tồn bằng trypsin tạo ra 23 peptide cĩ trình tự GFFYTPK tương ứng với 7 amino acid
Luận án Tiến sĩ Kết quả –Biện luận
đầu C của chuỗi B trong MPI (Hình 3.8 A). Hình 3.9 trình bày sắc ký đồ khối phổ nhận dạng trình tự FFYTPKTR của MPI. Các kết quả cho thấy MPI được biểu hiện cĩ trình tự amino acid tương ứng trình tự đã cơng bố trên ngân hàng gen cĩ
mã số truy cập gi:266373[76].
(A)
(B)
Hình 3.8. Nhận diện các peptide được tạo thành từ sự thủy phân MPI.
A, Các peptide thu được từ MPI chứa trình tự GFFYTPK. B, Nhận diện peptide tạo ra trên MPI.
Luận án Tiến sĩ Kết quả –Biện luận
Hình 3.9. Sắc ký đồ MS/MS đoạn peptide chứa trình tự FFYTPTR của MPI.
3.2.Lên men E. coli BL21(DE3)/pET43Ins tổng hợp 6xHis-MPI tái tổ hợp ở qui mơ phịng thí nghiệm và qui mơ pilot MPI tái tổ hợp ở qui mơ phịng thí nghiệm và qui mơ pilot 3.2.1. Hoạt hĩa, nhân giống và kiểm tra khả năng biểu hiện 6xHis-MPI
của chủng E. coli BL21(DE3)/pET43Ins
Chủng E. coli BL21(DE3)/pET43Ins được nuơi cấy mơi trường LB agar để
thu nhận khuẩn lạc đơn dùng để hoạt hĩa và nuơi cấy. Kết quả theo dõi động học tăng trưởng của chủng trong quá trình nhân giống được biểu diễn theo Hình
3.10. Quá trình nhân giống kết thúc sau 6,5 giờ nuơi cấy, đạt OD600nm = 1,7. Phân tích nồng độ tế bào khơ (DCW) đạt 4,9 g/L. Lúc này chủng đang ở pha tăng
Luận án Tiến sĩ Kết quả –Biện luận
trưởng, cĩ hoạt tính tốt nhất, dùng làm giống mầm cho các thí nghiệm về sau của
nghiên cứu này. Giống mầm được bảo quản trong tủ lạnh 4oC, sử dụng trong 1
tuần. Hiệu suất sinh tổng hợp tế bào tính trên cơ chất cao nấm men Yx/s đạt 49%
(Yx/s=4,9/10*100 = 49%). 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 0 1 2 3 4 5 6 7
Thời gian nuơi cấy (giờ)
O
D
600nm
Hình 3.10. Động học tăng trưởng của chủng E. coli BL21(DE3)/pET43Ins trong mơi trường LB.
Chủng E. coli BL21(DE3)/pET43Ins sau quá trình nhân giống được tiến
hành nuơi cấy để kiểm tra sự biểu hiện theo phương pháp đã trình bày trong mục
2.4.4. Kết quả kiểm tra biểu hiện theo phương pháp điện di SDS-PAGE và xác
nhận sự biểu hiện bằng phương pháp Western Blot được trình bày trên Hình 3.11.
Kết quả trên Hình 3.11 A cho thấy thấy ở giếng 3 cĩ xuất hiện một vạch kích
thước khoảng 9 kDa, tương ứng với kích thước của 6xHis-MPI trong khi đĩ ở chứng âm (giếng 2) khơng thấy xuất hiện vạch protein này. Kết quả xác nhận protein biểu hiện bằng phương pháp lai Western Blot với kháng thể kháng
Luận án Tiến sĩ Kết quả –Biện luận
ứng với 6xHis-MPI. Từ đĩ cĩ thể kết luận rằng chủng E. coli
BL21(DE3)/pET43Ins nuơi cấy tạo giống mầm cĩ khả năng biểu hiện 6xHis- MPI vượt mức khi được cảm ứng bằng IPTG và giống mầm này cĩ thể sử dụng được để phục vụ cho các thí nghiệm lên men nghiên cứu cảm ứng biểu hiện sau này.
Hình 3.11. Kết quả kiểm tra sự biểu hiện 6xHis-MPI của chủng E. coli BL21(DE3)/ pET43Ins.
A, SDS-PAGE; B, Western Blot. Giếng 1, Thang protein; 2, E. coli BL21(DE3)/pET43Ins; 3, E. coli BL21(DE3)/pET43Ins/IPTG.
3.2.2. Khảo sát các điều kiện biểu hiện tối ưu 6xHis-MPI của E. coli
BL21(DE3)/pET43Ins
Nhằm xác định các điều kiện tối ưu để tổng hợp 6xHis-MPI từ chủng E.
coli BL21(DE3)/pET43Ins, tiến hành khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ, nồng
độ IPTG và thời gian cảm ứng lên sự biểu hiện 6xHis-MPI.
6xHis-MPI
Luận án Tiến sĩ Kết quả –Biện luận a. Khảo sát nhiệt độ cảm ứng tối ưu
Để xác định được điều kiện nhiệt độ cảm ứng tối ưu, chúng tơi tiến hành
khảo sát ở các nhiệt độ khác nhau từ 25oC đến 37oC. Các bước thực hiện như đã
mơ tả trong phần Phương pháp 2.4.6. Kết quả thu nhận được trình bày trên Hình
3.12.
A B
Hình 3.12. Kết quả khảo sát nhiệt độ cảm ứng biểu hiện tối ưu.
A, SDS-PAGE; B, Western Blot. Giếng 1, Thang protein; 2, Chứng âm; 3, Cảm ứng biểu hiện ở 25oC; 4, Cảm ứng ở nhiệt độ 30oC; 5, Cảm ứng ở nhiệt độ 35oC; 6, Cảm ứng ở nhiệt độ 37oC.
Kết quả trên Hình 3.12Acho thấy ở các giếng 3, 4, 5, 6 cĩ xuất hiện vạch
protein cĩ kích thước khoảng 9 kDa được xác nhận là 6xHis-MPI (bằng phương
pháp lai Western Blot, Hình 3.12B) khi được cảm ứng bằng IPTG, trong khi đĩ ở
giếng 2 (khơng cảm ứng) khơng thấy cĩ xuất hiện vạch protein này. Kết quả phân tích mức độ biểu hiện bằng phầm mềm Quantity One (Biorad) dựa vào đậm độ của vạch protein trên bản điện di SDS-PAGE cho thấy khi nuơi cấy và
cảm ứng biểu hiện chủng E. coli BL21(DE3)/pET43Ins ở các nhiệt độ khác nhau
từ 25Ỉ 35oC đều cĩ biểu hiện 6xHis-MPI tốt với mức biến động từ 15,4%-
15,9% tổng protein tế bào, ở nhiệt độ cảm ứng 37oC, mức độ biểu hiện là 14,4%.
Luận án Tiến sĩ Kết quả –Biện luận
Chúng tơi chọn điều kiện cảm ứng 30oC để tiến hành các thí nghiệm nghiên cứu
về sau.
b. Khảo sát nồng độ IPTG cảm ứng biểu hiện tối ưu
Nồng độ chất cảm ứng IPTG cĩ vai trị quan trọng trong việc quyết định
mức độ biểu hiện protein mục tiêu của chủng E. coli BL21(DE3)/pET43Ins. Để
xác định được nồng độ cảm ứng biểu hiện tối ưu, chúng tơi tiến hành khảo sát bằng cách thay đổi nồng độ IPTG bổ sung vào trong giai đoạn cảm ứng. Các
bước tiến hành thí nghiệm như đã được trình bày trong phần Phương pháp 2.4.6,
với nhiệt độ cảm ứng là 30oC.Kết quả thu nhận được trình bày trên Hình 3.13.
A B
Hình 3.13. Kết quả khảo sát nồng độ IPTG cảm ứng tối ưu.
A, SDS-PAGE; B, Western Blot. Giếng 1, Thang protein; 2, Chứng âm; 3, IPTG 0,1 mM; 4, IPTG 0,2 mM; 5, IPTG 0,3 mM; 6, IPTG 0,4 mM; 7, IPTG 0,5 mM; 8, IPTG 0,6 mM.
Kết quả điện di SDS-PAGE trên Hình 3.13 A cho thấy, khi nuơi cấy chủng
E. coli BL21(DE3)/pET43Ins cĩ cảm ứng bằng IPTG thì đều cĩ sự xuất hiện vạch protein cĩ kích thước khoảng 9 kDa, được xác định là protein dung hợp
6xHis-MPI (giếng 3Ỉ 8). Trong khi đĩ, ở trường hợp khơng cĩ cảm ứng (giếng
2) thì khơng cĩ sự biểu hiện protein này. Khi tăng nồng độ chất cảm ứng IPTG 14,4kDa
Luận án Tiến sĩ Kết quả –Biện luận
từ 0,1 mM lên 0,3 mM (từ giếng 3 đến giếng 5) thì mức độ biểu hiện 6xHis-MPI tương ứng cũng tăng từ 6,4% lên 9,1%. Tuy nhiên, nếu tiếp tục tăng nồng độ chất cảm ứng từ 0,3 mM đến 0,6 mM thì mức độ biểu hiện vẫn khơng thay đổi, dao động ở mức từ 9,1-11,3% (giếng 6, 7, 8). Điều kiện cảm ứng 0,3 mM được chọn làm cơ sở cho các thí nghiệm nghiên cứu về sau.
c. Khảo sát thời gian cảm ứng biểu hiện tối ưu
Tiến hành khảo sát thời lượng cảm ứng phù hợp nhất để thu nhận protein mục tiêu với điều kiện thực hiện như đã được mơ tả trong phần Vật liệu – Phương pháp và sử dụng các kết quả thu nhận được của các thí nghiệm nghiên cứu trước.
Hình 3.14. Kết quả khảo sát thời lượng cảm ứng tối ưu.
A, SDS-PAGE; B, Western Blot. Giếng 1, Thang protein; 2, Chứng âm; 3, cảm ứng16 giờ; 4, cảm ứng 20 giờ; 5, cảm ứng 24 giờ; 6, cảm ứng 28 giờ.
Kết quả thu được trên Hình 3.14 cho thấy khi chủng E. coli
BL21(DE3)/pET43Ins được cảm ứng bằng IPTG (giếng 3, 4, 5, 6 Hình 3.14 A)
cĩ xuất hiện các vạch protein được xác nhận là 6xHis-MPI bằng phương pháp lai
Western Blot với kháng thể kháng Histidine, (Hình 3.14 B). Trong khi đĩ trên
giếng 2 (khơng cảm ứng) thì khơng cĩ vạch protein này. Ở thời lượng cảm ứng 14,4kDa
Luận án Tiến sĩ Kết quả –Biện luận
16 giờ, mức độ biểu hiện 6xHis-MPI đạt 9,3%. Khi tăng thời lượng cảm ứng từ 20 giờ đến 28 giờ (giếng 4, 5, 6) thì mức độ biểu hiện cũng tăng và dao động từ 10,4-11,2%. Chúng tơi chọn thời lượng cảm ứng biểu hiện là 20 giờ làm cơ sở cho các nghiên cứu sau.
Từ các kết quả khảo sát thu được trên đây chúng tơi cĩ thể kết luận rằng