- Phương pháp Bradford
Luận án Tiến sĩ Vật liệu – Phương Pháp
+Xây dựng đường chuẩn: để cĩ dung dịch albumin chuẩn cĩ các nồng độ từ 0-50 μg/ml theo Bảng 2.4.
Bảng 2.4. Các dung dịch albumin cĩ nồng độ khác nhau để xây dựng đường chuẩn protein
Ống nghiệm số 0 1 2 3 4 5
Nồng độ albumin (μg/ml) 0 10 20 30 40 50
Dung dịch albumin 0,1 mg/ml (ml) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
Nước cất (ml) 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5
+ Tiến hành hai lơ thí nghiệm, mỗi lơ 6 ống nghiệm đánh số theo thứ tự:
Thí nghiệm 1: 0a, 1a, 2a, 3a, 4a, 5a. Thí nghiệm 2: 0b, 1b, 2b, 3b, 4b, 5b. Tại thời điểm 0 phút, cho 5ml dung dịch thuốc thử Bradford vào ống nghiệm 0a, lắc đều, để yên. Tại thời điểm 1 phút, cho 5ml dung dịch thuốc thử Bradford vào ống nghiệm 0b, lắc đều, để yên. Thực hiện việc bổ sung 5ml dung dịch thuốc thử tuần tự vào các ống 1a, 1b, ...5a, 5b ở các thời điểm cách nhau 1 phút. Đến thời điểm 11 phút, cho 5ml dung dịch thuốc thử vào ống 5b, lắc đều, để yên. Khi thời gian ống 0a được 20 phút, tiến hành đo độ hấp thụ của ở bước sĩng 595nm (OD595nm). Tính thời gian ống 0b được 21 phút, tiến hành đo OD595nm. Tuần tự tiến hành đo OD của các ống cịn lại tại các thời điểm cách nhau 1 phút. Đến thời điểm 31 phút tiến hành đo ống 5b. Lấy giá trị trung bình của hai ống a và b. Trị số mật độ quang của dung dịch protein (ΔOD595nm) được tính như sau:
ΔOD595nm = OD595nm(cĩ protein)- OD595nm(khơng cĩ protein)
Dựng đường tuyến tính giữa nồng độ protein (μg/ml) với mật độ quang
ΔOD595nm. Mẫu thí nghiệm cũng được tiến hành tương tự như trên. Mẫu được pha
Luận án Tiến sĩ Vật liệu – Phương Pháp - Định lượng protein bằng máy quang phổ Nanodrop-1000
Nguyên tắc của phương pháp này là các protein hấp thụ tia cực tím cực đại ở bước sĩng 280nm do các amino acid thơm như tryptophan, tyrosin và phenylalanine. Máy quang phổ UV-VIS NanoDrop ND-1000 cho phép phân tích
với độ chính xác cao với một lượng mẫu nhỏ (μl). Sức căng bề mặt được sử dụng
để giữ một cột chất lỏng của mẫu ở vị trí để ánh sáng truyền qua thuận tiện cho
phép đo. Dùng pippet nhỏ trực tiếp một lượng nhỏ (2μl) mẫu vào vị trí đo, dưới
tác dụng của sức căng bề mặt, cột chất lỏng của mẫu được kéo lên, lúc này cĩ thể thực hiện phép đo với thời gian nhỏ hơn 10 giây. Phổ đồ và các phân tích cĩ thể hiện trên màn hình máy tính với phần mềm hổ trợ đi kèm [66].