Cyanogen Bromide (CNBr) là một hĩa chất cĩ khả năng nhận biết và cắt liên kết peptide ngay sau methionine (Met) trong chuỗi polypeptide [16]. Trong
Luận án Tiến sĩ Vật liệu – Phương Pháp
quá trình thiết kế plasmid pET43Ins, chúng tơi đã chèn một Met vào giữa vị trí
của thẻ 6xHis và MPI theo thứ tự H2N-6xHis-Met-MPI (Hình 2.2), do đĩ CNBr
cĩ thể nhận biết và cắt loại 6xHis ra khỏi MPI. Ngồi ra, MPI cĩ thể liên kết với
Zn2+ hình thành phức hợp tủa nên cĩ thể sử dụng dung dịch muối ZnCl2 để tủa
nhanh MPI trong điều kiện biến tính. Bổ sung 2 thể tích ZnCl2 0,1 M vào phân
đoạn tinh chế 6xHis-MPI thu được ở trên, ly tâm thu tủa ở 6000 g, 15 phút, 4oC,
rửa tủa hai lần bằng nước cất. Hịa tan tủa trong dung dịch đệm cho phản ứng cắt CNBr đến nồng độ cuối là 3 mg/ml. Bổ sung dung dịch CNBr đến nồng độ cuối 300 mM, ủ ở nhiệt độ phịng trong 16 giờ ở trong bĩng tối. Bổ sung 2 thể tích
ZnCl2 0,5 M vào hỗn hợp phản ứng cắt, để ở 4oC trong 30 phút. Ly tâm thu tủa,
rửa tủa 5 lần bằng nước cất để loại CNBr. Hịa tan tủa thu được vào trong dung
dịch gắn (2.2.1.k) và cho nạp lại qua cột Ni-NTA với mục đích “bắt giữ” 6xHis-
MPI chưa được cắt cĩ trong phần tủa và thẻ 6xHis đã bị cắt. Thu nhận các phân đoạn dịch protein vừa ra khỏi cột là các phân đoạn chứa MPI. Điều kiện thực
hiện tinh chế giống như trong phần 2.4.13. Phân tích MPI thu được bằng điện di
trên gel SDS-PAGE và Western Blot với kháng thể kháng histidine và kháng thể kháng insulin.