100 ml dịch thể vùi biến tính thu được trong phần trên dùng làm nguyên liệu để tinh chế thu nhận 6xHis-MPI bằng sắc ký ái lực với cột Ni-NTA theo
phương pháp như đã được trình bày trong mục 2.4.13. Kết quả được ghi nhận
trong Bảng 3.4.
Bảng 3.4. Kết quả thu nhận và tinh chế sơ bộ 6xHis-MPI từ thể vùi bằng cột Ni- NTA
Phân đoạn Thể tích, ml Nồng độ, mg/ml Lượng protein, mg
Dịch hịa tan thể vùi trước
khi qua cột 100 23,56 2.356
Dịch 6xHis-MPI thu được
Luận án Tiến sĩ Kết quả –Biện luận
Như vậy chúng tơi đã thu nhận được 278,64 × (423,2/100) = 1,179 g 6xHis-MPI từ 148,311 g sinh khối khơ.
Hiệu suất thu nhận 6xHis-MPI từ tế bào: 1,179g/148,311g = 7,951 mg/g.
Hiệu suất thu nhận 6xHis-MPI từ thể vùi: 1,179g/62,55 g = 18,85 mg/g
Để đánh giá độ tinh sạch của protein 6xHis-MPI sau khi tinh chế qua cột Ni-NTA trên đây, chúng tơi tiến hành phân tích bằng điện di SDS-PAGE và xác nhận kết quả bằng phương pháp lai Western Blot với kháng thể kháng 6xHis. Kết quả được ghi nhận trên Hình 3.21.
Hình 3.21. Kiểm tra độ tinh sạch của 6xHis-MPI sau khi tinh chế qua cột Ni-NTA. A, SDS-PAGE; B, Western Blot với kháng thể kháng His. Giếng 1, Thang protein; 2, Dịch 6xHis-MPI biến tính trước khi qua cột; 3, Phân đoạn dịch gắn protein lên cột; 4, Phân đoạn dịch rửa protein khơng đặc hiệu; 5, Phân đoạn dung ly protein ra khỏi cột.
Ở phân đoạn dung ly protein đặc hiệu (giếng 5) cĩ sự xuất hiện của một vạch protein cĩ kích thước khoảng 9 kDa, tương ứng với vạch protein ở giếng 2 (dịch 6xHis-MPI biến tính trước tinh chế) được nhận diện là protein dung hợp 6xHis-MPI. Trong khi đĩ ở giếng 3, giếng 4, là các phân đoạn dịch rửa trước khi
Luận án Tiến sĩ Kết quả –Biện luận
dung ly protein đặc hiệu 6xHis-MPI thì khơng thấy cĩ vạch protein này. Khi kiểm tra bằng phương pháp lai Western Blot (B) với kháng thể kháng 6xHis, chúng tơi nhận thấy cĩ tín hiệu dương ở giếng số 2 và giếng số 5, tương ứng với
vạch protein trên Hình 3.21 A, trong khi đĩ, ở giếng 3 và giếng 4 khơng thấy sự
xuất của vạch protein này.
Từ kết quả trên cĩ thể khẳng định chúng tơi đã thành cơng trong việc tinh chế protein dung hợp 6xHis-MPI từ dịch lên men qui mơ pilot. Đây là nguồn nguyên liệu 6xHis-MPI dùng để phục vụ cho các mục đích thu nhận MPI và insulin của các nghiên cứu sau.