phương pháp PCR tái tổ hợp
Gen mpi biểu hiện mini-proinsulin dạng dung hợp với thẻ 6xHis (6xHis-
MPI) ở trong tế bào chất của E. coli được thiết kế dựa vào thơng tin trình tự
insulin người trên ngân hàng gen (Genebank, NM_000207). Đoạn C trong proinsulin được thiết kế thay thế bằng một đoạn peptide cĩ 9 amino acid (Hình
2.1), tối ưu hĩa codon E. coli dựa vào thơng tin từ tài liệu “Codon usage in E.
coli” [29]. Gen đích mpi được tổng hợp bằng phương pháp PCR tái tổ hợp dựa
trên các cặp mồi được thiết kế theo Bảng 2.3.
Hình 2.1. Sơ đồ cấu trúc hệ thống biểu hiện gen mpi.
Promotor sử dụng trong thiết kế này là T7 promotor, cặp enzyme cắt giới
hạn là NdeI/XhoI trong hệ thống biểu hiện pET-43.1a. Trong cấu trúc trình tự
amino acid của 6xHis-MPI (Hình 2.2) cĩ đoạn peptide dung hợp chứa thẻ 6xHis
Luận án Tiến sĩ Vật liệu – Phương Pháp
Hình 2.2. Sơ đồ trình tự amino acid của 6xHis-MPI.
Trình tự amino acid của các vùng khác nhau của 6xHis-MPI như sau: Đoạn peptide dung hợp: PSDKPHHHHHHSSGSM
Đoạn C:RRYPGNVKR
Đoạn A: GIVEQCCTSICSLYQLENYCN
Đoạn B: FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT
Trọng lượng phân tử của 6xHis-MPI là 8,71kDa, của MPI là 6,92kDa. Thơng thường các gen của tế bào eukaryote biểu hiện kém hiệu quả trong các hệ thống biểu hiện ở vi khuẩn (prokaryote). Một trong những nguyên nhân gây ra sự biểu hiện kém này là do các codon trên bộ gen của tế bào eukaryote khơng được sử dụng ở tế bào vi khuẩn. Để khắc phục, chúng tơi tiến hành thiết
kế một gen mpi tổng hợp cĩ mang các codon được “ưa thích” ở prokaryote bằng
phương pháp PCR hai bước [11]. Dựa vào trình tự gen insulin người được cơng
bố trên ngân hàng gen (GenBank, NM_000207), bộ mã của E. coli và kết quả
cơng bố bởi Shin và cộng sự (1997) [59], chúng tơi thiết kế hai cặp mồi Ins1F/Ins2R và Ins3F/Ins4R, các mồi trong mỗi cặp và giữa hai cặp mồi cĩ các vùng gối lên nhau khoảng 20 nucleotide cĩ thể bắt cặïp bổ sung với nhau. Ngồi ra, để hỗ trợ cho quá trình dịng hĩa và tinh chế về sau, mồi Ins1F và Ins4R cịn
chứa vị trí nhận biết của enzyme cắt giới hạn NdeI và XhoI và Ins1F chứa vùng
gen mã hĩa thẻ tinh chế 6xHis ở đầu N của MPI (Bảng 2.3). Phản ứng PCR thứ
Luận án Tiến sĩ Vật liệu – Phương Pháp
ứng được trộn chung với nhau theo tỉ lệ 1:1 để làm khuơn mẫu cho phản ứng PCR kế tiếp với cặp mồi Ins1F/Ins4R. Sản phẩm thu được của lần PCR thứ hai chính là gen mpi (Hình 2.3).
Hình 2.3. Sơ đồ minh họa sự tổng hợp gen mpi bằng phương pháp PCR hai bước. 1, Mồi Ins1F; 2, Mồi Ins2R; 3, Mồi Ins3F; 4, Mồi Ins4R.
Thành phần của phản ứng PCR tổng hợp như sau:
- Phản ứng PCR1: dNTP (2 mM mỗi loại) 10 μl; Đệm PCR (10X) 10 μl;
Mồi Ins1F/ Ins3F (100 pmol) 1,0 μl; Mồi Ins2R/ Ins4R (100 pmol) 1,0 μl; Pfu
DNA polymerase 2,5U; Nước cất đủ 100 μl. Sản phẩm PCR thu được tương ứng
với mỗi cặp mồi được đặt tên là SP12 và SP34, được tinh chế qua cột GFX và được dùng làm khuơn cho phản ứng PCR2.
Luận án Tiến sĩ Vật liệu – Phương Pháp
- Phản ứng PCR2: dNTP (2mM mỗi loại) 10 μl; Đệm PCR (10X) 10 μl;
SP12 (100 ng/μl) 1,0 μl; SP34 (100 ng/μl) 1,0 μl; Mồi Ins1F (10 pmol) 2,0 μl;
Mồi Ins4R (10 pmol) 2,0 μl; Pfu DNA polymerase 2,5U; Nước cất đủ 100 μl.
Sản phẩm thu được từ PCR2 chính là gen mpi, được khuếch đại bằng phản
ứng PCR tái tổ hợp và được điện di kiểm tra trên gel agarose 1,5%, tinh chế giữ lại cho mục đích tạo dịng.
Chương trình chạy PCR tổng hợp gen mpi thực hiện theo phản ứng PCR1
và PCR2 như sau: 95oC, 5 phút; [95oC, 30 giây; 72oC, 2 phút] x 30 chu kỳ; 72oC, 10 phút; giữ 4oC.