dạng dung hợp 6xHis-MPI
3.1.3.1. Cấu trúc plasmid pET43Ins tái tổ hợp biểu hiện 6xHis-MPI
Plasmid biểu hiện pET-43.1a được chọn để tạo dịng gen mpi và biểu hiện
trong E. coli. Sơ đồ qui trình tạo dịng được trình bày ở Hình 3.4.
Plasmid pBIns từ dịng tế bào E. coli DH5α/pBIns được thu nhận và xử lý
bằng NdeI và XhoI. Điện di DNA plasmid trên gel agarose 0,8% để thu nhận
đoạn gen mpi. Sau khi được tinh chế qua cột GFX, gen mpi được chèn vào
plasmid pET-43.1a đã được mở vịng cũng bằng cặp enzyme cắt giới hạn
NdeI/XhoI. Biến nạp hỗn hợp sản phẩm nối vào dịng E. coli DH5α và trải trên
mơi trường LB-Amp, ủ và chọn các khuẩn lạc mọc trên mặt agar làm khuẩn lạc dự tuyển. Tách chiết plasmid từ dịng khuẩn lạc dự tuyển, xử lý với cặp enzyme
NdeI/XhoI, sản phẩm cắt được điện di trên gel agarose để kiểm tra kích thước
của plasmid và đoạn gen mpi và kiểm tra mức độ đồng khung của gen mpi sau
khi dịng hĩa vào plasmid biểu hiện pET-43.1a.
Kết quả điện di cho thấy ở giếng sản phẩm cắt (giếng 2), cĩ hai vạch cĩ
kích thước 5.409bp, tương ứng với kích thước của pET-43.1a/NdeI-XhoI và
250bp, tương ứng với kích thước của gen mpi (Hình 3.5). Kết quả kiểm tra mức
độ đồng khung của gen mpi trên plasmid pET43Ins cho thấy mức độ đồng khung
Luận án Tiến sĩ Kết quả –Biện luận
Hình 3.4. Sơ đồ tái tạo dịng gen mpi từ plasmid pBIns vào plasmid pET-43.1a tạo plasmid tái tổ hợp pET43Ins biểu hiện 6xHis-MPI.
Luận án Tiến sĩ Kết quả –Biện luận
Hình 3.5. Kết quả sàng lọc dịng E. coli DH5α mang plasmid pET43Ins bằng phương pháp cắt giới hạn.
Giếng 1, Thang DNA 1kb; 2, Plasmid pET43Ins cắt bằng NdeI /XhoI; 3, Gen mpi.
Hình 3.6. Kết quả kiểm tra mức độ đồng khung của gen mpi trên plasmid pET43Ins.
Luận án Tiến sĩ Kết quả –Biện luận
Như vậy, chúng tơi đã tái tạo dịng thành cơng gen mpi vào plasmid biểu
hiện pET-43.1a tạo plasmid tái tổ hợp pET43Ins mang gen mpi dung hợp mã hĩa
mini-proinsulin dạng dung hợp với thẻ 6xHis (6xHis-MPI).
3.1.3.2. Tạo dịng E. coli BL21(DE3)/pET43Ins biểu hiện 6xHis-MPI
Plasmid pET43Ins được biến nạp vào tế bào E. coli BL21(DE3) bằng
phương pháp điện biến nạp.Thể biến nạp được sàng lọc bằng cách nuơi cấy trên
mơi trường LB-Amp. Các khuẩn lạc mọc được trên mơi trường này được chọn
làm dịng dự tuyển để kiểm tra sự biểu hiện protein 6xHis-MPI của gen mpi.
Tiến hành thí nghiệm theo các thao tác như ở mục 2.4.3, 2.4.4. Kết quả phân tích
SDS-PAGE (Hình 3.7 A) cho thấy cĩ sự xuất hiện một vạch protein cĩ kích thước
khoảng 9 kDa (giếng 5) khi dịng E. coli BL21(DE3)/pET43Ins được cảm ứng với
IPTG. Đây là dạng protein dung hợp giữa MPI và thẻ 6xHis. Các mẫu đối chứng (giếng 2, 3, 4) khơng xuất hiện vạch protein này. Ở giếng 3, xuất hiện vạch
protein cĩ kích thước khoảng 64 kDa khi dịng E. coli BL21(DE3)/pET-43.1a
được cảm ứng, đây là protein HisTag-NusA được mã hĩa bởi plasmid pET-43.1a, được sử dụng như một chứng dương nhằm xác nhận là plasmid pET-43.1a được
biến nạp vào chủng E. coli BL21(DE3) cũng cĩ thể biểu hiện được các protein
theo trình tự trên plasmid khi được cảm ứng bằng IPTG. Plasmid pET43Ins đã được cắt bỏ vùng gen mã hĩa cho HisTag-NusA trong quá trình cắt nối nên khi cảm ứng chỉ cĩ thể biểu hiện 6xHis-MPI (giếng 5). Kết quả này cho thấy dịng
tế bào E. coli BL21(DE3) cĩ mang pET43Ins cĩ khả năng tổng hợp protein dung
hợp 6xHis-MPI.
Vạch protein trên SDS-PAGE (ở giếng 5) được khẳng định là protein dung hợp 6xHis-MPI bằng phương pháp Western Blot sử dụng kháng thể kháng 6xHis
và kháng thể HUI-001 kháng insulin. Các bước thao tác như đã được trình bày
Luận án Tiến sĩ Kết quả –Biện luận
Trường hợp sử dụng kháng thể kháng 6xHis, bản hiện phim Hình 3.7 B cho thấy
cĩ sự xuất hiện hai vạch: vạch 9 kDa tương ứng với 6xHis-MPI và vạch 64 kDa tương ứng với HisTag-NusA (chứng dương) trên gel của SDS-PAGE. Trường hợp
sử dụng kháng thể kháng insulin (Hình 3.7 C), chỉ xuất hiện một vạch tương ứng
với vạch khoảng 9 kDa là của 6xHis-MPI (giếng 5). Các kết quả này cho phép
kết luận rằng protein cĩ trọng lượng phân tử khoảng 9 kDa biểu hiện từ chủng E.
coli BL21(DE3)/pET43Ins chính là protein dung hợp 6xHis-MPI.
Hình 3.7. Kiểm tra sự biểu hiện của 6xHis-MPI bởi E. coli BL21(DE3)/pET43Ins. A, Kết quả điện di SDS-PAGE; B, Kết quả lai Western-Blot với kháng thể kháng 6xHis; C, Western-Blot với kháng thể HUI-001 kháng insulin. 1, Thang phân tử lượng protein; 2, E. coli BL21 (DE3); 3, E. coli BL21 (DE3)/pET43.1.a/IPTG; 4, E. coli BL21 (DE3)/pET43Ins; 5, E. coli BL21 (DE3)/pET43Ins/IPTG.