Tái gấp cuộn (refolding) là quá trình làm thay đổi cấu hình protein từ dạng khơng gấp cuộn sang dạng gấp cuộn tự nhiên. Quá trình tái gấp cuộn thực chất là quá trình thay đổi cấu hình của protein mà các vùng chứa nhiều amino acid kỵ nước được gấp cuộn vào bên trong và các phần, vùng ưa nước được phơi lên bề mặt cho đến khi protein đạt được cấu hình cĩ mức năng lượng thấp nhất
[14],[19],[20]. Sau đây là một số phương pháp tái gấp cuộn protein in vitro đã
được nghiên cứu.
- Phương pháp pha lỗng
Phương pháp tái gấp cuộn đơn giản nhất là pha lỗng dung dịch protein- chất biến tính bằng dung dịch tái gấp cuộn đến khi đạt nồng độ cuối protein 10-
100 μg/ml. Phương pháp này chỉ thích hợp với qui mơ phịng thí nghiệm do độ
pha lỗng cao, nồng độ protein thấp. Cĩ thể cải tiến phương pháp này bằng cách pha lỗng từng đợt hay liên tục protein biến tính bằng dung dịch tái gấp cuộn để làm tăng nồng độ cuối cùng của protein. Việc bổ sung dung dịch protein biến tính phải được tiến hành ở tốc độ thấp hơn tốc độ tái gấp cuộn để tránh hiện
Luận án Tiến sĩ Tổng quan
tượng tích lũy các cấu hình trung gian cĩ khuynh hướng kết tụ. Lượng protein được bổ sung ở mỗi đợt phải được tối ưu hĩa bằng thực nghiệm [24],[65],[67].
- Phương pháp thẩm tích
Protein biến tính được thẩm tích bằng dung dịch tái gấp cuộn để nồng độ chất biến tính giảm theo thời gian đạt đến mức bằng nồng độ của dung dịch tái gấp cuộn. Ngược với phương pháp pha lỗng trực tiếp, phương pháp này cần đổi dung dịch thẩm tích nhiều lần. Protein mục tiêu phải trải qua các nồng độ chất biến tính khác nhau, điều này cĩ thể tạo ra nhiều cấu hình trung gian cĩ khuynh hướng kết tụ. Mặt khác, hiệu suất tái gấp cuộn cĩ thể bị ảnh hưởng bởi sự liên kết khơng đặc hiệu của protein với màng thẩm tích. Một phương pháp cải tiến khá đơn giản là thẩm tích nhiều bước với nồng độ chất biến tính giảm dần như trong phương pháp pha lỗng trực tiếp. Ở mỗi nồng độ trung gian, các cấu hình trung gian cĩ thể gây gấp cuộn sai hoặc kết tụ, tuy nhiên, nồng độ chất biến tính trung gian cho phép phân tử protein dao động và chuyển thành cấu hình tự nhiên. Phương pháp này cĩ thể áp dụng đối với protein cĩ nhiều domain vì mỗi domain gấp cuộn và cĩ tính bền vững khác nhau ở các nồng độ chất biến tính khác nhau [65],[67].
- Phương pháp sắc ký
Quá trình tái gấp cuộn protein cĩ thể được tiến hành bằng sắc ký lọc gel (size exclusive chromatography- SEC) dựa trên nguyên tắc trao đổi buffer để loại bỏ chất biến tính. Trước hết, dung dịch protein biến tính được cho vào cột đã được cân bằng với dung dịch tái gấp cuộn. Sau đĩ thực hiện quá trình dung ly nhằm thu protein đã gấp cuộn. Protein cĩ thể gấp cuộn hồn tồn trong cột hay ở phân đoạn dung ly đối với các protein cĩ động học gấp cuộn chậm. Ưu điểm của SEC là làm giảm sự kết tụ nhờ sự phân tách vật lý các cấu hình trung gian cĩ khuynh hướng kết tụ trong cấu trúc xốp của gel. Đồng thời phương pháp này
Luận án Tiến sĩ Tổng quan
cũng giúp tinh sạch protein đích trong quá trình tái gấp cuộn. Nhược điểm của phương pháp SEC là hiệu suất gấp cuộn thấp do sự kết tụ protein trong quá trình nạp mẫu.
Cĩ thể tiến hành tái gấp cuộn bằng cách cố định protein biến tính lên giá thể rắn trước khi thay đổi dung dịch đệm nhằm mục đích tránh các tương tác khơng mong muốn giữa các cấu trúc trung gian tái gấp cuộn. Protein đã gấp cuộn cĩ thể được dễ dàng tách ra khỏi giá thể sau khi đổi dung dịch đệm. Sự cố định protein lên giá thể rắn được thực hiện thơng qua việc thiết kế một peptide dung hợp hỗ trợ sự gắn của protein dung hợp lên giá thể rắn (ví dụ 6xHis, GST…). Sau khi được gắn lên giá thể rắn, protein biến tính được tái gấp cuộn bằng các kỹ thuật như pha lỗng, thẩm tích hay trao đổi dịch đệm nhờ sắc ký. Ưu điểm của phương pháp này là kết hợp được bước tái gấp cuộn và bước tinh chế protein. Trong quá trình tái gấp cuộn protein, một số chất phân tử lượng nhỏ thường được sử dụng để thúc đẩy hiệu quả tái gấp cuộn. Urea hoặc guanidine HCl thường được thêm vào trong dung dịch tái gấp cuộn ở nồng độ đủ thấp để gấp cuộn hiệu quả, nhưng đủ cao để duy trì tính tan và sự linh động của các cấu trúc trung gian. Tuy nhiên, việc sử dụng 2 chất này vẫn khơng tạo được hiệu quả như mong muốn, do đĩ cần phải bổ sung thêm các chất cùng hịa tan nhằm làm giảm mức độ gấp cuộn sai và sự kết tụ. Các chất hỗ trợ tái gấp cuộn cĩ thể được chia làm hai loại: (i) Chất xúc tiến gấp cuộn, giúp xúc tiến tương tác giữa protein-protein, bao gồm đường, đường đa, muối ammonium sulfate, magnesium chloride, và glycine và alanine; (ii) Chất hạn chế sự kết tụ, làm giảm các tương tác kỵ nước nên hạn chế được sự kết tụ của các cấu hình trung gian, bao gồm polyethylene glycol, cyclodextrin, Arginine HCl, proline. Polyethylene glycol và cyclodextrin tác dụng lên vùng kỵ nước của cấu hình trung gian đang gấp cuộn,
Luận án Tiến sĩ Tổng quan
ngăn cản hiện tượng kết tụ. Trong số các chất trên, arginine HCl thường được sử dụng nhất tuy nhiên cơ chế tác dụng vẫn chưa được hiểu rõ [20],[32],[43].
Hầu hết các protein đều cĩ liên kết disulfide khi ở cấu hình tự nhiên. Khi tiến hành tái gấp cuộn các protein chứa các cầu nối disulfide, cần tạo mơi trường cĩ tính ơxi hĩa để hỗ trợ cho việc ơxi hĩa các nhĩm -SH thành -S-S-. Các phương pháp thường được sử dụng để thúc đẩy sự ơxi hĩa trong quá trình tái gấp cuộn này bao gồm: sử dụng ơxi của khơng khí, sử dụng hệ thống ơxi hĩa khử, sử dụng các cầu nối disulfide phức hợp ơxi hĩa các protein đã được sulfonate hĩa.
Cầu nối disulfide được hình thành do sự ơxi hĩa các nhĩm –SH của cysteine bởi ơxi. Do tốc độ và năng suất tạo các liên kết disulfide bằng ơxi khơng khí thường thấp nên thơng thường phản ứng này được xúc tiến thơng qua sự trao đổi với hợp chất chứa -SH cĩ khối lượng phân tử thấp. Cặp glutathione khử và ơxi hĩa (GSH/GSSH), cặp cysteine/cystine, cysteamine/cystamine, di- hydroxyethyl disulfide/2-mercaptoethanol là các cặp chất ơxi hĩa-khử chứa nhĩm –SH thường dùng. Việc sử dụng cặp ơxi hĩa khử nào để đạt hiệu quả tốt hơn phụ thuộc vào loại protein thể vùi cụ thể. Các tác nhân ơxi hĩa-khử làm tăng tốc độ và năng suất tạo thành các cầu nối disulfide đúng bằng cách sắp xếp lại các liên kết disulfide khơng đúng. Đối với hầu hết các protein, sự hình thành các liên kết disulfide là tốt nhất khi cĩ sự hiện diện của 1-3 mM thiol dạng khử và xấp xỉ 1/5 - 1/10 dạng ơxi hĩa [14],[19],[32].