Insulin người tái tổ hợp được sản xuất theo hai phương án: (1) Biểu hiện hai chuỗi A, B độc lập sau đĩ thực hiện phản ứng tạo cầu nối disulfide hình thành phân tử insulin (phương án hai chuỗi); (2) Sản xuất proinsulin tái tổ hợp sau đĩ dùng enzyme đặc hiệu (trypsin/carboxypeptidase) cắt bỏ đoạn peptide C tạo insulin cĩ hoạt tính (phương án một chuỗi). Gần đây, thay cho proinsulin trong phương án một chuỗi, người ta biểu hiện mini-proinsulin (cĩ đoạn C ngắn hơn so với trường hợp proinsulin) để sản xuất insulin.
1.3.2.1. Sản xuất insulin tái tổ hợp bằng phương án hai chuỗi
Chế phẩm insulin tái tổ hợp của người đầu tiên được thu nhận bằng cách gắn hai đoạn cDNA mã hĩa cho chuỗi A và chuỗi B vào plasmid, dịng hĩa vào
các tế bào E. coli khác nhau (chủng K12) và biểu hiện hai chuỗi A, B tái tổ hợp
riêng rẽ. Hai chuỗi peptide A, B sau đĩ được tinh sạch tạo các cầu nối disulfide để hình thành insulin cĩ hoạt tính. Năm 1999, Michael Schmidt và cộng sự cơng
bố một nghiên cứu về “Sản xuất insulin người bằng E.coli tái tổ hợp với cảm
ứng nhiệt” theo phương án hai chuỗi. Hai chuỗi A, B được tổng hợp riêng rẽ trên
hai hệ thống biểu hiện sử dụng promotor của phage lamda (λ-PL), cảm ứng biểu
hiện bằng nhiệt độ. Tiến hành tinh chế hai chuỗi này khỏi các thể vùi, sau đĩ cho thực hiện đúng cầu nối disulfide nhờ các dẫn xuất của S-sulfonate để hình thành insulin cĩ hoạt tính với hiệu suất biểu hiện của chuỗi A, B đạt tương ứng
Luận án Tiến sĩ Tổng quan
là 600 mg/L và 800 mg/L mơi trường nuơi cấy. Ưu điểm của phương án hai chuỗi so với phương án một chuỗi là khơng cần phải dùng các enzyme để cắt bỏ đoạn peptide trung gian. Tuy nhiên phương án này cĩ một số nhược điểm là cần cĩ hai hệ thống biểu hiện và tinh chế độc lập cho hai chuỗi A, B; hiệu suất và độ chính xác của quá trình tạo cầu nối disulfide khơng cao [27],[57].
1.3.2.2. Sản xuất insulin dạng proinsulin tái tổ hợp (phương án một chuỗi)
Proinsulin được thiết kế theo nguyên tắc là dung hợp với một protein/peptide nhằm mục đích tăng cường biểu hiện và giữ được cấu trúc của proinsulin ổn định sau dịch mã. Trong trình tự này thường cĩ một đoạn peptide hỗ trợ việc tinh chế (ví dụ 6xHis) chèn thêm một amino acid vào đầu N của proinsulin là Arg hoặc Lys để tạo vị trí cần cho việc cắt bỏ đoạn protein dung hợp (fusion protein) ra khỏi insulin sau này. Do vậy, cấu trúc phức hợp này thường là Met-peptide/protein dung hợp-Arg/Lys- Proinsulin. Sau đây là một số hướng tiếp cận trong sản xuất insulin người tái tổ hợp theo phương án một chuỗi.
- Biểu hiện proinsulin tái tổ hợp trong tế bào chất
Preproinsulin được biểu hiện ở dạng thể vùi khơng tan trong tế bào chất
trong E. coli bởi hệ thống vector pGEX-6T ở dạng dung hợp 6xHis-GST-
preproinsulin, dưới sự kiểm sốt của promotor Ptac với chất cảm ứng là IPTG.
Trong điều kiện nuơi cấy thích hợp sau 24 giờ, sự biểu hiện của preproinsulin cĩ thể đạt đến 20% của tổng protein của tế bào. Protein dung hợp này sau đĩ được thu hồi và tinh chế bằng sắc ký ái lực dựa trên thẻ 6xHis. Sử dụng enterokinase để cắt bỏ đoạn protein dung hợp ra khỏi preproinsulin với trình tự nhận biết được
thiết kế là VDDDDKG chèn vào giữa GST và preproinsulin [13].
Met-Lys-Proinsulin được biểu hiện trong E. coli với promotor được kiểm
Luận án Tiến sĩ Tổng quan
giản bằng Sephadex G50, khoảng 150mg Met-Lys-proinsulin tái tổ hợp được thu nhận với độ tinh khiết đạt 90% từ 1 lít dịch lên men. Sử dụng cặp enzyme trypsin/carboxypeptidase B để xử lý chuyển proinsulin thành insulin. Hiệu suất thu nhận là 50 mg/L mơi trường lên men [17].
Met-Arg-proinsulin-GFP được biểu hiện trong tế bào chủng E.coli
BL21(DE3) khi cảm ứng bởi IPTG đến mức 20-25%, khoảng 140mg/L mơi trường lên men. Met-Arg-proinsulin được xử lý bởi trypsin và carboxypeptidase B thành insulin người [17],[21].
ZZ-Arg-Proinsulin với đoạn ZZ được nhận diện và gắn bởi kháng thể IgG
được biểu hiện trong E. coli ở mức khoảng 25% tổng protein tế bào và khoảng 3
g/L mơi trường nuơi cấy. Phức hợp protein tinh chế thơng qua sắc ký ái lực với IgG để thu nhận proinsulin dung hợp tinh khiết và được xử lý bằng trypsin/carboxypeptidase B để thu nhận insulin cĩ hoạt tính [31],[49].
- Biểu hiện proinsulin tái tổ hợp trong chu chất
Việc biểu hiện proinsulin trong tế bào chất E. coli thường tạo thành các
thể vùi chứa proinsulin khơng tan. Proinsulin khơng tan trong thể vùi cần được làm tan bằng các muối cĩ nồng độ cao, sau đĩ cần được tái gấp cuộn để cĩ cấu hình tự nhiên trước khi xử lý bằng protease để thu được insulin cĩ hoạt tính. Để tránh các bước phức tạp nêu trên, một phương án được tiếp cận nghiên cứu là
biểu hiện proinsulin tan trong chu chất (periplasm) của E. coli. Để proinsulin
được vận chuyển qua màng tế bào chất của E. coli đi vào chu chất thì cần phải
gắn thêm vào đầu N của proinsulin một trình tự mã hĩa một đoạn peptide tín hiệu (signal peptide) cĩ vai trị hướng proinsulin ra chu chất. Sau đây là một số cơng trình nghiên cứu theo hướng này đã được cơng bố.
Peptide tín hiệu của β-lactamase từ Staphylococcus aureus với trình tự
Luận án Tiến sĩ Tổng quan
proinsulin. Sự biểu hiện cĩ thể đạt 27 phân tử proinsulin ở trong chu chất trong 1 tế bào E.coli [60].
Một cách tiếp cận khác để tạo proinsulin tái tổ hợp dạng tan cĩ cấu hình
tái gấp cuộn tự nhiên trong chu chất của E. coli là dung hợp với DsbA, một
enzyme xúc tác sự hình thành cầu nối disulfide. Tính ổn định của protein tái tổ
hợp được sản xuất trong tế bào E. coli phụ thuộc chặt chẽ vào hiệu quả gấp cuộn
trong in vivo. Do vậy, khoang chu chất của tế bào vi khuẩn là nơi thích hợp cho
sự biểu hiện của proinsulin. Chu chất tạo ra mơi trường cĩ điều kiện ơxi hĩa và các protein thuộc nhĩm Dsb* (DsbA, DsbC và DsbG) xúc tác cho sự thành lập các cầu nối disulfide trong chu chất. DsbA là oxydase quan trọng nhất của nhĩm
sulhydryl trong chu chất, hỗ trợ tạo cầu nối disulfide của các protein trong in
vitro rất hiệu quả. Trong cách tiếp cận này DsbA cùng với peptide tín hiệu vốn cĩ của protein này được dung hợp vào đầu N của proinsulin để tạo ra pre-DsbA- proinsulin. Phức hợp này được vận chuyển qua màng tế bào chất vào chu chất thành DsbA-proinsulin. DsbA sẽ giúp ổn định nội phân tử proinsulin chưa gấp khúc thơng qua các điểm liên kết polypeptide và tạo các cầu nối disulfide. Hiệu suất tối đa của proinsulin người thu nhận được từ phần hịa tan trong chu chất sau khi cắt loại bỏ DsbA là 9,2 mg/g protein chu chất, tương đương 1,8% tổng lượng protein tế bào [73].
- Biểu hiện proinsulin tái tổ hợp tiết ra mơi trường
Một số chủng vi sinh vật khác được sử dụng cho việc biểu hiện proinsulin
tái tổ hợp dạng tiết ra mơi trường [64]. Sau đây là một vài cơng trình tiêu biểu
cho hướng nghiên cứu này.
Nấm men Pichia pastoris và Sacchromyces cerevisiae cĩ các đặc điểm rất
giống nhau về việc tiết insulin ra mơi trường. Tương tự như E. coli, sự vận
Luận án Tiến sĩ Tổng quan
diện bởi hệ thống tiết của tế bào. Ở P. pastoris, prepro-leader peptide giúp sự
tiết ngoại bào của proinsulin. Ngồi ra, trình tự peptide này dùng làm đoạn nối (spacer) giữa prepro-leader peptide và proinsulin cùng ảnh hưởng đến hiệu suất tạo và tiết proinsulin trong P. pastoris [36],[53].
Trong một nghiên cứu dùng S. cerevisiae làm chủng chủ biểu hiện và tiết
proinsulin. Proinsulin được dung hợp ở đầu N với nhân tố α, một peptide tín hiệu
làm nhiệm vụ tiết ra protein dung hợp ra ngồi. Protein dung hợp sau đĩ được biểu hiện và tiết ra mơi trường nuơi cấy với hiệu suất cĩ thể đạt 41,1mg/L mơi trường [37].
Một cách tiếp cận khác để tạo proinsulin tiết vào mơi trường là sử dụng
Bacillus subtilis làm chủng chủ. Trong trường hợp này trình tự peptide tín hiệu
aprE từ B. subtilis được dung hợp với đầu N của proinsulin để giúp vận chuyển
proinsulin qua màng tế bào vào mơi trường (B. subtilis là vi khuẩn gram dương
chỉ cĩ màng tế bào chất, khơng cĩ màng ngồi như trong trường hợp của E. coli).
Hiệu suất tạo proinsulin là 1 g/L mơi trường nuơi cấy và 90% lượng biểu hiện này được tiết ra mơi trường nuơi cấy 1 giờ sau pha ổn định [52].
1.3.2.3. Sản xuất insulin bằng phương án một chuỗi dạng mini-proinsulin tái tổ hợp
Nhiều nghiên cứu cho thấy việc thay đoạn peptide C cĩ chứa 35 amino acid bằng một đoạn peptide ngắn hơn cũng tạo được dạng tiền thân của insulin, gọi là mini-proinsulin (MPI), cĩ cấu hình tự nhiên giống proinsulin nhưng cĩ hiệu suất gấp cuộn cao hơn. Lars Thim và cộng sự (1987) [53] đã tiếp cận nghiên cứu sản xuất insulin thơng qua mơ hình mini-proinsulin với đoạn mini-C
là 6 amino acid (Arg-Arg-Leu-Gln-Lys-Arg) bằng nấm men S. cerevisiae. Kang
và cộng sự (1994) [34] đã thiết kế và biểu hiện thành cơng phức hợp ZZ- miniproinsulin trong đĩ chiều dài đoạn peptide C thay đổi từ 1-11 amino acid.
Luận án Tiến sĩ Tổng quan
Hiện nay, vai trị của đoạn peptide C trong cấu trúc của proinsulin của động vật chưa được xác định rõ ràng, chiều dài và trình tự amino acid của đoạn peptide C này thay đổi từ 26-38 đơn phân tùy vào từng lồi động vật. Tuy nhiên cấu trúc căn bản tại các vị trí gần khu vực liên kết của chuỗi B-C và C-A là khơng thay đổi và được xem là yêu cầu tối thiểu để chuyển proinsulin thành insulin cĩ hoạt
tính [14],[15],[34]. Năm 2005, Dorschug và cộng sự đăng ký bản quyền (US
patent) về mơ hình mini-proinsulin, biểu hiện bởi E. coli hoặc ở nấm men
Saccharomyces cerevisiae, với đoạn C chỉ cĩ một amino acid là Arg sau đĩ sử dụng trypsin và carboxypeptidase để biến đổi thành insulin [23].
Tuy nhiên cho đến nay chỉ cĩ các cơng bố sản xuất insulin người tái tổ hợp thơng qua mơ hình mini-proinsulin ở qui mơ phịng thí nghiệm, chưa cĩ cơng bố ở qui mơ sản xuất [15]. Sau đây là hai nghiên cứu tiêu biểu về tổng hợp insulin theo mơ hình mini-proinsulin.
Shin và cộng sự (1997) [59] đã thiết kế mini-proinsulin (M2PI) với đoạn peptide C chỉ cĩ 9 amino acid Arg-Arg-Tyr-Pro-Gly-Asn-Val-Lys-Arg. M2PI được dung hợp ở đầu N một peptide T2 gồm 18 amino acid Pro-Ser-Asp-Lys-
Pro-(His)10-Ser-Ser-Met cĩ vai trị ổn định protein dung hợp và hỗ trợ việc tinh
chế bằng sắc ký ái lực giữa 10xHis và cột sắc ký Ni-NTA. Khi được biểu hiện
trong E. coli bởi hệ thống vector biểu hiện pET-3a, hiệu suất biểu hiện protein
dung hợp T2-M2PI cĩ thể đạt 7 g/L và khoảng 62% của phức hợp này cĩ thể được chuyển thành insulin cĩ hoạt tính sau khi qua các bước xử lý tiếp theo. Như vậy, việc sản xuất insulin tái tổ hợp thơng qua mơ hình mini-proinsulin biểu hiện
trong tế bào chất của E. coli dạng thể vùi cho mức độ biểu hiện cao.
Chang và cộng sự (1998) [16] đã thiết kế mini-proinsulin M2PI tương tự như Shin (1997) và dung hợp với peptide T2 chứa 21 amino acid thay vì 18 amino acid trong đĩ bổ sung thêm một Met ở đầu N và Gly-Ser trước Met ở đầu
Luận án Tiến sĩ Tổng quan
C (Met-Pro-Ser-Asp-Lys-Pro-His10-Ser-Ser-Gly-Ser-Met-M2PI). Khi được biểu
hiện trong E. coli bằng hệ thống vector biểu hiện pET-3a, phức hợp T2-M2P
được tạo ra dưới dạng thể vùi với hàm lượng đạt đến 25% tổng protein của tế bào. Phần dung hợp T2 sau đĩ được cắt bỏ bởi CNBr và M2PI mini-proinsulin được tinh sạch bằng sắc ký trao đổi ion. Hiệu suất tái gấp cuộn của M2PI mini- proinsulin tốt hơn từ 20-40% so với hiệu suất gấp cuộn của proinsulin.
1.3.2.4. Tình hình nghiên cứu sản xuất insulin trong nước
Ở Việt Nam, cơng trình nghiên cứu sản xuất insulin tiếp cận theo hướng
biểu hiện proinsulin ở tế bào E. coli của nhĩm tác giả PGS.TS. Lê Văn Phủng và
cộng sự thực hiện đề tài cấp bộ (Bộ Y tế) [6],[7]. Kết quả cơng bố cho thấy đã
thiết kế thành cơng gen biểu hiện proinsulin trên E. coli BL21(DE3) bằng vector
pET-28a(+) và khảo sát được các điều kiện tối ưu để biểu hiện proinsulin.
Hiện nay, nhĩm nghiên cứu thuộc trung tâm cơng nghệ sinh học thành phố Hồ Chí Minh thực hiện tạo dịng biểu hiện mini-proinsulin trên đối tượng là
nấm men Pichia pastosis [5]. Theo kết quả cơng bố thì hiện đang ở giai đoạn tạo
dịng Pichia pastosis cĩ khả năng biểu hiện mini-proinsulin, tuy nhiên mức độ
biểu hiện cịn rất thấp.