Dịch nuơi cấy được ly tâm ở 6.000g, 15 phút để thu phần sinh khối lắng tụ. Huyền phù hĩa sinh khối tế bào trong dung dịch đệm ly giải (Tris-HCl 50 mM; EDTA 1 mM; NaCl 50 mM), tiến hành phá tế bào để thu nhận thể vùi. Sinh khối tế bào được huyền phù hĩa bằng thiết bị Microfluidizer (M-110EH-30) ở điều kiện áp suất là 22.000 psi, tốc độ dịng nạp 320 ml/phút và hồi lưu qua máy 5 lần [45]. Dịch đồng nhất được dùng để thu nhận thể vùi và 6xHis-MPI.
Luận án Tiến sĩ Vật liệu – Phương Pháp 2.4.12. Thu nhận và làm tan thể vùi chứa 6xHis-MPI
Dịch đồng nhất tế bào E. coli BL21(DE3)/pET43Ins được bổ sung thêm
MgCl2 đạt 10 mM để làm giảm độ nhớt và ly tâm ở 6.000g, 30 phút để thu nhận
thể vùi, cặn tủa chứa thể vùi được huyền phù hĩa trong đệm rửa (dung dịch ly giải chứa 0,5 M urea, 0,5% Triton X-100 v/v) và ly tâm 6.000g trong 30 phút. Thu nhận tủa và rửa tủa thêm hai lần như trên. Ở lần rửa thứ 3 khơng sử dụng Triton X-100 trong thành phần của đệm rửa. Thể vùi được làm tan trong dung dịch làm tan biến tính chứa 6M guanidine-HCl; 20 mM Tris-HCl; pH 8; 0,5 M NaCl; 5 mM imidazole. Thực hiện phản ứng sulfonate hĩa các nhĩm –SH trong 6xHis-MPI bằng cách bổ sung sodium sulfite và sodium tetrathionate đến nồng độ cuối tương ứng là 0,3 M và 0,06 M. Ủ hỗn hợp phản ứng ở nhiệt độ phịng trong 24 giờ. Ly tâm loại bỏ tủa khơng tan ở 6.000 g trong 30 phút [62],[30].
2.4.13. Thu nhận và tinh chế sơ bộ 6xHis-MPI bằng sắc ký cột Ni-NTA
Phần dung hợp 6xHis trong 6xHis-MPI giúp thu nhận và tinh chế sơ bộ 6xHis-MPI hoặc để loại 6xHis sau khi bị cắt khỏi 6xHis-MPI. 6xHis-MPI trong
dịch nổi sau phản ứng sulfonate hĩa ở phần 2.4.12 được thu nhận và tinh chế sơ
bộ trong điều kiện biến tính bằng hệ thống FPLC với cột tinh chế Ni-NTA. Lắp cột Ni-NTA (5 ml, 100 ml) vào hệ thống AKTA FPLC, cân bằng cột với 250 ml dung dịch B (binding). Nạp mẫu vào cột và rửa với dung dịch B cho đến khi chỉ
số OD280nm của hệ thống nhỏ hơn 0,01 (hệ thống cân bằng). Nạp dung dịch rửa
(C) đến khi hệ thống cân bằng và dung ly protein mục tiêu với dung dịch D (2.2.1.k), thu nhận phân đoạn dung ly.
2.4.14. Phương pháp cắt loại bỏ 6xHis bằng CNBr để thu nhận MPI
Cyanogen Bromide (CNBr) là một hĩa chất cĩ khả năng nhận biết và cắt liên kết peptide ngay sau methionine (Met) trong chuỗi polypeptide [16]. Trong
Luận án Tiến sĩ Vật liệu – Phương Pháp
quá trình thiết kế plasmid pET43Ins, chúng tơi đã chèn một Met vào giữa vị trí
của thẻ 6xHis và MPI theo thứ tự H2N-6xHis-Met-MPI (Hình 2.2), do đĩ CNBr
cĩ thể nhận biết và cắt loại 6xHis ra khỏi MPI. Ngồi ra, MPI cĩ thể liên kết với
Zn2+ hình thành phức hợp tủa nên cĩ thể sử dụng dung dịch muối ZnCl2 để tủa
nhanh MPI trong điều kiện biến tính. Bổ sung 2 thể tích ZnCl2 0,1 M vào phân
đoạn tinh chế 6xHis-MPI thu được ở trên, ly tâm thu tủa ở 6000 g, 15 phút, 4oC,
rửa tủa hai lần bằng nước cất. Hịa tan tủa trong dung dịch đệm cho phản ứng cắt CNBr đến nồng độ cuối là 3 mg/ml. Bổ sung dung dịch CNBr đến nồng độ cuối 300 mM, ủ ở nhiệt độ phịng trong 16 giờ ở trong bĩng tối. Bổ sung 2 thể tích
ZnCl2 0,5 M vào hỗn hợp phản ứng cắt, để ở 4oC trong 30 phút. Ly tâm thu tủa,
rửa tủa 5 lần bằng nước cất để loại CNBr. Hịa tan tủa thu được vào trong dung
dịch gắn (2.2.1.k) và cho nạp lại qua cột Ni-NTA với mục đích “bắt giữ” 6xHis-
MPI chưa được cắt cĩ trong phần tủa và thẻ 6xHis đã bị cắt. Thu nhận các phân đoạn dịch protein vừa ra khỏi cột là các phân đoạn chứa MPI. Điều kiện thực
hiện tinh chế giống như trong phần 2.4.13. Phân tích MPI thu được bằng điện di
trên gel SDS-PAGE và Western Blot với kháng thể kháng histidine và kháng thể kháng insulin.
2.4.15. Khảo sát các điều kiện ảnh hưởng lên sự tái gấp cuộn của MPI
Sản phẩm MPI thu được sau khi thực hiện phản ứng cắt bỏ đuơi 6xHis với CNBr tiếp tục tiến hành thí nghiệm tái gấp cuộn nhằm thu nhận MPI ở dạng cấu hình tự nhiên. Dung dịch đệm tái gấp cuộn chứa glycine (là hợp chất khử giúp hạn chế sự kết tụ của các protein do cĩ khả năng làm tăng hằng số điện mơi của nước, tăng độ hịa tan của protein). Ngồi ra, dung dịch tái gấp cuộn cịn được bổ sung một số các chất khác như glycerol, Tris… và sự cĩ mặt của cặp ơxi hĩa khử
Luận án Tiến sĩ Vật liệu – Phương Pháp
cysteine/cystine tạo thế ơxi hĩa khử thích hợp để hỗ trợ sự tái gấp cuộn của MPI.
Để khảo sát các điều kiện thích hợp cho quá trình tái gấp cuộn, chúng tơi tiến hành thực hiện tái gấp cuộn theo phương pháp loại dung dịch biến tính
(urea) bằng cột loại muối HistrapTM (desalting) thơng qua hệ thống AKTA FPLC
và tái gấp cuộn dựa trên phương pháp ơxi hĩa bằng ơxi của khơng khí. Hiệu quả phản ứng tái gấp cuộn được đánh giá bằng phương pháp ELISA và bằng sắc ký RP-HPLC.
Các bước thực hiện được tiến hành theo Tjissen (1985) [63]. Lắp cột loại
muối (HistrapTM desalting) vào hệ thống AKTA FPLC, cân bằng cột với dung
dịch tái gấp cuộn. Nạp mẫu vào cột và thu nhận mẫu protein sau khi ra khỏi cột. Dung dịch protein đã loại muối đem thực hiện phản ứng tái gấp cuộn với dung
dịch đệm ở nhiệt độ phịng (25oC) trong 16 giờ. Dung dịch đệm tái gấp cuộn cĩ
thành phần gồm Tris-HCl 50 mM; EDTA 2 mM; Glycine 50 mM; NaCl 0,3 M; Cysteine 5 mM; Cystine 0,5 mM, Glycerol 5%. Hiệu chỉnh pH 11,5 bằng NaOH 5 M.
Trường hợp khảo sát ảnh hưởng của pH, hiệu chỉnh pH 10,6 và 11,5 bằng NaOH/HCl; các thành phần khác của dung dịch đệm phản ứng khơng thay đổi. TFA được bổ sung đến nồng độ cuối 2% để dừng phản ứng. Hiệu quả tái gấp cuộn được đánh giá bằng phương pháp ELISA.
Để thực hiện tái gấp cuộn MPI ở qui mơ lớn nhằm thu được MPI hàm lượng cao, chúng tơi thực hiện tái gấp cuộn theo phương pháp pha lỗng từng đợt (pulse dilution) [72]. Mẫu MPI tinh sạch được tiến hành tái gấp cuộn bằng cách bổ sung từng đợt vào trong dung dịch tái gấp cuộn cĩ chứa cặp ơxi hĩa khử cysteine/cystine. Ban đầu, nồng độ protein thấp nên cĩ đủ khơng gian để hình thành đúng cầu nối S-S và giúp làm giảm hiện tượng kết tụ của protein. Ưu điểm
Luận án Tiến sĩ Vật liệu – Phương Pháp
của phương pháp này cho phép kiểm sốt được thể tích của hỗn hợp dịch tái gấp cuộn dựa vào nồng độ của dung dịch protein trước tái gấp cuộn. Điều này cho phép cĩ thể sử dụng phương pháp này ở qui mơ lớn để tái gấp cuộn MPI. Sử dụng các điều kiện tái gấp cuộn như đã khảo sát trong thí nghiệm trước. Mẫu MPI được bổ sung vào theo tần suất 60 phút/lần đến khi đạt nồng độ protein cuối khoảng 0,5 mg/ml. Thời gian tái gấp cuộn là 24 giờ kể từ lần bổ sung cuối cùng.
2.4.16. Tủa mini-proinsulin và insulin bằng ion kẽm kim loại
Dung dịch protein sau khi tái gấp cuộn được hiệu chỉnh pH 8,1 bằng dung
dịch HCl 1 N. Bổ sung dung dịch ZnCl2, citric acid và acetone để đạt nồng độ
cuối tương ứng là 0,16%, 0,5%, 16%. Giữ ở 4oC trong vịng 24 giờ. Ly tâm
6.000g ở 4oC trong 40 phút thu tủa và rửa tủa 2 lần bằng nước cất. Hịa tan tủa
trong HCl 0,1 N để thu nhận dịch MPI tái gấp cuộn [14].
2.4.17. Phương pháp xử lý MPI bằng trypsin/carboxypeptidase B để thu nhận insulin cĩ hoạt tính thu nhận insulin cĩ hoạt tính
Trypsin là một endopeptidase cĩ khả năng nhận biết và thủy phân liên kết peptide giữa 2 amino acid cĩ tính kiềm như Arg-Arg hay Lys-Arg. Ở trường hợp của MPI, trypsin sẽ cắt bỏ đoạn mini peptide giữa chuỗi A và B tuy nhiên vẫn cịn Arg trên chuỗi A và chuỗi B. Arginine này sẽ được cắt bỏ bởi carboxypeptidase B (cĩ hoạt tính exopeptidase chuyên biệt với amino acid cĩ tính base). Carboxypeptidase B đặc hiệu cắt loại Lysine hoặc Arginine ở đầu C của phân tử peptide. Dựa vào kết quả cơng bố của Winter và cộng sự [73], của Dorschug [23] và thơng tin về trypsin, carboxypeptidase của Sigma, chúng tơi tiến hành thí nghiệm phản ứng cắt loại đoạn peptide C từ mini-proinsulin theo điều kiện: tỷ lệ enzyme/mini-proinsulin của trypsin và carboxypeptidase B lần
Luận án Tiến sĩ Vật liệu – Phương Pháp
3 giờ. Dừng phản ứng bằng trypsin inhibitor (Sigma). Sản phẩm cắt được điện di phân tích trên gel SDS-PAGE 16%. Insulin thu nhận từ phản ứng được phân tích cấu hình tự nhiên bằng phương pháp điện di SDS-PAGE, ELISA và tính tương đồng với insulin chuẩn bằng phương pháp RP-HPLC.
2.4.18. Kiểm tra cấu hình của MPI và insulin bằng phương pháp ELISA ELISA
Phương pháp ELISA gián tiếp với kháng thể đơn dịng OXI-005 cĩ khả năng nhận diện và gắn lên epitope lập thể trên MPI tái gấp cuộn được sử dụng để đánh giá hiệu quả tái gấp cuộn MPI. Kháng nguyên (MPI tái gấp cuộn hoặc insulin) được cố định lên giếng sẽ tương tác với kháng thể OXI-005 và tiếp đến kháng thể này được phát hiện nhờ kháng thể kháng Ig cộng hợp. Qui trình ELISA gián tiếp được thực hiện qua các bước:
- Cố định kháng nguyên: Để đảm bảo nguyên vẹn cấu trúc khơng gian của MPI hoặc insulin, kháng nguyên thử nghiệm được cố định trên giếng trong
dung dịch PBST, pH 7,2 với lượng 250 ng protein/giếng, ủ 37oC trong 2 giờ.
- Khĩa màng: Các vị trí cịn trống trên giếng khơng cĩ insulin được phong
tỏa. Bổ sung 100 μl dung dịch blocking 5% (sữa gầy) vào tất cả các giếng, ủ
25oC trong 1 giờ, rửa bằng dung dịch PBST.
- Ủ với kháng thể OXI-005: kháng thể sử dụng với lượng 250 ng cho mỗi giếng được pha lỗng trong dung dịch serum lỗng; Ủ trong 1 giờ ở nhiệt độ phịng; Rửa bằng dung dịch PBST.
- Ủ với kháng thể thứ cấp: bổ sung 100μl/giếng kháng thể kháng Ig (anti-
Ig) chuột đánh dấu HRP pha lỗng 1/10.000 vào tất cả các giếng; Ủ trong 1 giờ ở
Luận án Tiến sĩ Vật liệu – Phương Pháp
- Đọc kết quả: cơ chất của HRP là dung dịch OPD-H2O2 được bổ sung vào
tất cả các giếng (100 μl/giếng). Ủ trong tối ở nhiệt độ phịng khoảng 30 phút sau
đĩ bổ sung H2SO4 2N để dừng phản ứng tạo màu. Đo cường độ màu ở bước sĩng
492nm bằng máy Multiskan Ascent. Kết quả OD492nm của 2 giếng cùng điều kiện
(A, B) được tính trung bình cộng [11].
2.4.19. Phân tích MPI và insulin bằng sắc ký RP-HPLC
Hệ thống máy RP-HPLC với cột C18 (GL Science Inc) 4,6mm/250mm được sử dụng để đánh giá sự tái gấp cuộn của MPI và cấu hình tự nhiên của insulin. Điều kiện tiến hành sắc ký như sau:
- Chuẩn bị các dung dịch: (A)-Acetonitrile: dung dịch nước 3:1 (TFA 0,1%); (B): dung dịch nước (TFA 0,1%); (C): Nước; (D): Isopropanol.
- Chương trình chạy: 0 phút: 90% B-10% A; 5 phút 90% B-10% A; 45 phút: 10% B-90% A; 50 phút: 0% B-100% A; 60 phút: 0% B-100% A; 65 phút 90% B-10% A; 70 phút 90% B-10% A.
Lưu lượng 1 ml/phút; Thời gian chạy 60 phút; Lượng mẫu nạp 20 μl; Bước
sĩng hấp thu 215nm [11].
2.4.20. Giải trình tự amino acid của MPI bằng khối phổ
MPI trên gel SDS-PAGE sau khi cắt loại 6xHis được phân tích xác định trình tự tại Viện Cơng Nghệ Sinh Học (Viện khoa học và Cơng nghệ Việt Nam) bằng phương pháp MS/MS (Mass Spectrometry/Mass Spectrometry). Các bước thực hiện và kết quả được trình bày trong phần Phụ lục.
2.4.21. Phương pháp định lượng protein - Phương pháp Bradford - Phương pháp Bradford
Luận án Tiến sĩ Vật liệu – Phương Pháp
+Xây dựng đường chuẩn: để cĩ dung dịch albumin chuẩn cĩ các nồng độ từ 0-50 μg/ml theo Bảng 2.4.
Bảng 2.4. Các dung dịch albumin cĩ nồng độ khác nhau để xây dựng đường chuẩn protein
Ống nghiệm số 0 1 2 3 4 5
Nồng độ albumin (μg/ml) 0 10 20 30 40 50
Dung dịch albumin 0,1 mg/ml (ml) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
Nước cất (ml) 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5
+ Tiến hành hai lơ thí nghiệm, mỗi lơ 6 ống nghiệm đánh số theo thứ tự:
Thí nghiệm 1: 0a, 1a, 2a, 3a, 4a, 5a. Thí nghiệm 2: 0b, 1b, 2b, 3b, 4b, 5b. Tại thời điểm 0 phút, cho 5ml dung dịch thuốc thử Bradford vào ống nghiệm 0a, lắc đều, để yên. Tại thời điểm 1 phút, cho 5ml dung dịch thuốc thử Bradford vào ống nghiệm 0b, lắc đều, để yên. Thực hiện việc bổ sung 5ml dung dịch thuốc thử tuần tự vào các ống 1a, 1b, ...5a, 5b ở các thời điểm cách nhau 1 phút. Đến thời điểm 11 phút, cho 5ml dung dịch thuốc thử vào ống 5b, lắc đều, để yên. Khi thời gian ống 0a được 20 phút, tiến hành đo độ hấp thụ của ở bước sĩng 595nm (OD595nm). Tính thời gian ống 0b được 21 phút, tiến hành đo OD595nm. Tuần tự tiến hành đo OD của các ống cịn lại tại các thời điểm cách nhau 1 phút. Đến thời điểm 31 phút tiến hành đo ống 5b. Lấy giá trị trung bình của hai ống a và b. Trị số mật độ quang của dung dịch protein (ΔOD595nm) được tính như sau:
ΔOD595nm = OD595nm(cĩ protein)- OD595nm(khơng cĩ protein)
Dựng đường tuyến tính giữa nồng độ protein (μg/ml) với mật độ quang
ΔOD595nm. Mẫu thí nghiệm cũng được tiến hành tương tự như trên. Mẫu được pha
Luận án Tiến sĩ Vật liệu – Phương Pháp - Định lượng protein bằng máy quang phổ Nanodrop-1000
Nguyên tắc của phương pháp này là các protein hấp thụ tia cực tím cực đại ở bước sĩng 280nm do các amino acid thơm như tryptophan, tyrosin và phenylalanine. Máy quang phổ UV-VIS NanoDrop ND-1000 cho phép phân tích
với độ chính xác cao với một lượng mẫu nhỏ (μl). Sức căng bề mặt được sử dụng
để giữ một cột chất lỏng của mẫu ở vị trí để ánh sáng truyền qua thuận tiện cho
phép đo. Dùng pippet nhỏ trực tiếp một lượng nhỏ (2μl) mẫu vào vị trí đo, dưới
tác dụng của sức căng bề mặt, cột chất lỏng của mẫu được kéo lên, lúc này cĩ thể thực hiện phép đo với thời gian nhỏ hơn 10 giây. Phổ đồ và các phân tích cĩ thể hiện trên màn hình máy tính với phần mềm hổ trợ đi kèm [66].
2.4.22. Phương pháp xác định tính hoạt tính của insulin tái tổ hợp
Các bước thí nghiệm đánh giá hoạt tính insulin tái tổ hợp bao gồm: Chuẩn bị các lơ chuột đực, cho chuột nhịn ăn trong khoảng 4-5 giờ, cân xác định trọng lượng và tiêm sreptozotocin với liều lượng 100 mg/1 kg chuột. Chuẩn bị dung dịch insulin chuẩn làm chứng dương, chứng âm là dung dịch sinh lý PBS. Mẫu insulin tái tổ hợp được tiêm vào chuột với liều dùng là 10IU/mg trọng lượng cơ thể chuột, thể tích tiêm là 0,1 ml [55] , 3 con cho một điều kiện thí nghiệm. Tiến hành đánh giá hàm lượng đường trong máu của chuột sau 30 phút, 60 phút kể từ khi bắt đầu tiêm. Phương pháp đánh giá độ biến động hàm lượng đường trong máu chuột sau khi tiêm:
Độ biến động theo thời gian: S = St - S0
Độ biến động so với chứng âm: S = S - S (-)
Trong đĩ S0, St lần lượt là hàm lượng đường trong máu tại thời điểm bắt
đầu tiêm và sau tiêm t phút. S(-) là hàm lượng đường trong máu chuột trong
Luận án Tiến sĩ Kết quả –Biện luận
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN
3.1.Tạo dịng tế bào E. coli cĩ khả năng biểu hiện mini-proinsulin dung hợp với 6xHis (6xHis-MPI) proinsulin dung hợp với 6xHis (6xHis-MPI)
3.1.1. Tổng hợp gen mpi mã hĩa mini-proinsulin biểu hiện trong E. coli
Đoạn gen mpi được tổng hợp bằng phương pháp PCR tái tổ hợp 2 bước