a. Cảm ứng biểu hiện
Khuẩn lạc của E. coli BL21(DE3)/pET43Ins được cấy vào mơi trường LB
cĩ bổ sung 100 μg/ml ampicillin (LB-Amp), nuơi cấy lắc ở nhiệt độ 37oC đến khi
đạt OD600 = 0,8, bổ sung IPTG đạt nồng độ 0,5 mM. Tiếp tục nuơi cấy khoảng 6-
8 giờ, thu sinh khối tế bào để kiểm tra sự biểu hiện protein mục tiêu [51].
b. Kiểm tra sự biểu hiện 6xHis-MPI bằng phương pháp SDS- PAGE
Mẫu điện di được chuẩn bị bằng cách ly tâm dịch nuơi cấy đã được cảm
ứng bằng IPTG thu lượng sinh khối tương đương OD600nm = 2,5 (~2,5x109 tế bào)
trong ống eppendorf ở điều kiện 13.000 g trong 15 phút. Huyền phù sinh khối
với 100 μl nước cất, phá màng tế bào bằng sĩng siêu âm. Bổ sung 100 μl dung
dịch nạp mẫu 2X, đun cách thủy 5 phút ở 95oC. Ly tâm ở 13.000 g trong 10 phút,
Luận án Tiến sĩ Vật liệu – Phương Pháp
Các bước thực hiện điện di SDS-PAGE bao gồm việc chuẩn bị gel polyacrilamide theo hướng dẫn của nhà sản xuất (Hoefer mini VE Electrophoresis and Electrotransfer Unit) và của Ausubel (1992) [11] với các hĩa chất được liệt kê trong mục 2.2.1.c. Nạp 10-15 μl mẫu cĩ cảm ứng, 10-15 μl mẫu
khơng cĩ cảm ứng làm mẫu chứng âm và 5 μl thang protein vào mỗi giếng. Tiến
hành điện di ổn định dịng với cường độ 2 mA/giếng. Lấy gel ra khỏi tấm kính, cắt bỏ phần gel gom, đánh dấu một gĩc của gel phân tích, nhuộm gel với dung dịch nhuộm trong 1 giờ sau đĩ giải nhuộm bằng dung dịch giải nhuộm, thay dung dịch giải nhuộm sau mỗi 1 giờ cho đến khi nền gel trở nên trong suốt và vạch protein xuất hiện rõ. So sánh các vạch protein của mẫu với mẫu chứng âm, xác định vạch protein dung hợp; so sánh vạch protein dung hợp với thang protein, xác định kích thước của protein dung hợp.
Sử dụng phần mềm Quantity One (Biorad) để đánh giá mức độ biểu hiện 6xHis-MPI thơng qua đậm độ của vạch protein trên bản gel điện di.
c. Xác nhận sự biểu hiện protein dung hợp bằng Western Blot
Mẫu protein dung hợp 6xHis-MPI sau điện di SDS-PAGE được chuyển lên màng nitrocellulose bằng hệ thống điện chuyển thẩm. Protein 6xHis-MPI cĩ thể được phát hiện thơng qua kháng thể đặc hiệu trực tiếp (dùng kháng thể đã được đánh dấu) hoặc gián tiếp (dùng kháng thể chưa được đánh dấu và phát hiện kháng thể này bằng kháng thể thứ 2 đã được đánh dấu). Do 6xHis-MPI là protein dung hợp MPI với thẻ 6xHis nên cĩ thể dùng kháng thể kháng Histidine hoặc kháng thể kháng insulin làm kháng thể sơ cấp. Kháng thể thứ cấp IgG được
đánh dấu HRP (anti-His-HRP), khi gặp cơ chất là H2O2 và luminol thì HRP sẽ
thủy phân H2O2 đồng thời oxy hĩa luminol trở thành trạng thái kích hoạt, kém
Luận án Tiến sĩ Vật liệu – Phương Pháp
cĩ mặt của phenol, cường độ phát sáng tăng và thời gian phát sáng dài. Ánh sáng này cĩ bước sĩng ngắn và cĩ thể để lại tín hiệu trên phim.
- Chuyển màng: Điện di SDS-PAGE các mẫu và thang phân tử lượng protein đã nhuộm sẵn, cắt bỏ gel gom, đánh dấu gel phân tích, ngâm và lắc gel trong dung dịch chuyển màng (Towbin) trong 10 phút. Chuẩn bị một màng lai nitrocellulose, hai tấm giấy thấm cĩ kích thước phù hợp với kích thước của gel, ngâm trong dung dịch chuyển màng ít nhất 10 phút.
- Điện chuyển thẩm: Làm ướt tất cả các miếng xốp bằng dung dịch chuyển màng, sau đĩ xếp theo thứ tự cực âm, miếng xốp, gel, màng lai, giấy lọc, miếng xốp, cực dương. Bổ sung thêm dung dịch chuyển màng ngập các miếng xốp. Lắp vào bồn điện di, thực hiện chuyển màng với dịng điện 20 V, 200 mA trong 25 phút, lấy màng lai ra và đánh dấu mặt trên.
- Phát hiện protein bắt đặc hiệu với kháng thể: Đặt ngửa màng lai vào ống falcon, cho vào 10ml dung dịch Blocking, quay trịn ống falcon nhẹ nhàng trong 1 giờ cho dung dịch tiếp xúc đều với mặt trên của màng, rửa màng 2 lần với dung dịch PBST. Cho vào 10 ml dung dịch kháng thể, quay trịn ống falcon nhẹ nhàng trong 1 giờ cho dung dịch tiếp xúc đều với mặt trên của màng. Rửa màng 5 lần bằng dung dịch PBST trong 30 phút.
- Hiện phim: Đặt màng lai lên bìa nylon kiếng, phủ khắp bề mặt của
màng bằng 1ml hỗn hợp reagent 1 và 2 (bộ Kit HyperfilmTM ECL), đậy màng lai
bằng nylon, chuyển vào phịng tối, áp sát mặt phim lên phía trên đúng với vị trí của màng lai, giữ cố định 5-10 phút. Nhúng phim vào dung dịch developer đến khi vạch protein xuất hiện, nhanh chĩng chuyển phim sang dung dịch fixer, rửa đến khi nền phim trong suốt. Rửa phim lại bằng nước, mang ra khỏi phịng tối và lau khơ.
Luận án Tiến sĩ Vật liệu – Phương Pháp
Protein sau điện di được chuyển lên màng lai nitrocellulose, protein dung hợp được phát hiện nhờ kháng thể sơ cấp kháng 6xHis hoặc kháng thể HUI-001 kháng insulin và kháng thể thứ cấp đánh dấu HRP [11].