a. Thay thế trypton bằng pepton trong mơi trường LB
Nhằm mục tiêu tìm kiếm nguồn nguyên liệu rẻ tiền dùng cho lên men qui mơ lớn sau này, chúng tơi chọn pepton thay thế trypton trong mơi trường LB (giá của trypton là 1,955,000 đồng/kg cao gấp khoảng 1,5 so với của pepton, 1,324,000 đồng/kg (HIMEDIA, INDIA) (Việt Á, 2009)). Mơi trường LB với thành phần cĩ pepton được gọi là LBp. Tiến hành khảo sát sự tăng trưởng của
chủng E. coli BL21(DE3)/pET43Ins trên mơi trường nuơi cấy LB và LBp được
thực hiện như trong phần Phương pháp 2.4.7. Kết quả sau 6 giờ nuơi cấy (lúc kết
thúc pha tăng trưởng) được ghi nhận trên Hình 3.15 cho thấy khuynh hướng biến
Luận án Tiến sĩ Kết quả –Biện luận 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 0 1 2 3 4 5 6
Thời gian nuơi cấy, giờ
OD 600nm 6.2 6.3 6.4 6.5 6.6 6.7 6.8 6.9 7.0 7.1 7.2 pH OD LB OD LBp pH LB pH LBp
pH của mơi trường LBp luơn ở mức thấp hơn khoảng 0,2-0,5 đơn vị pH. Nguyên nhân là do pH của mơi trường LBp nhỏ hơn pH của mơi trường LB, do pH của pepton nhỏ hơn pH của trypton. Tuy nhiên khơng thấy cĩ sự khác biệt động học tăng trưởng của chủng trên hai loại mơi trường này. Như vậy, mặc dù pH của mơi trường LBp nhỏ hơn pH của mơi trường LB nhưng khơng gây ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của chủng. Giá trị pH thấp nhất khi nuơi cấy trên mơi trường LBp là 6,35 ở thời điểm nuơi cấy giờ thứ 2,5. Điều này cho thấy chủng cĩ thể tăng trưởng tốt ở giá trị pH thấp khoảng 6,30. Kết quả phân tích trọng lượng tế bào khơ (DCW) khi kết thúc quá trình lên men ở mơi trường LBp là 4,9 g/L, cao hơn trong trường hợp nuơi cấy trên mơi trường LB, 4,5 g/L.
Hình 3.15. Động học tăng trưởng của chủng E. coli BL21(DE3)/pET43Ins và sự biến động pH theo thời gian khi nuơi cấy trên mơi trường LBp và mơi trường LB.
Luận án Tiến sĩ Kết quả –Biện luận
Để đánh giá khả năng biểu hiện của chủng khi nuơi cấy trên mơi trường
LBp so với mơi trường LB, chúng tơi tiến hành thí nghiệm nuơi cấy chủng E. coli
BL21(DE3)/pET43Ins trên mơi trường LB và LBp bằng phương pháp nuơi cấy mẻ trên hệ thống lên men mini-jar ở qui mơ 5 L. Các bước thao tác như đã được
mơ tả trong phần Phương pháp 2.4.8. Các điều kiện kiểm sốt lên men theo các
kết quả thu nhận được từ các thí nghiệm trước. Kết quả kiểm tra mức độ biểu hiện theo phương pháp SDS-PAGE và xác nhận sự biểu hiện này bằng phương
pháp Western Blot được trình bày trên Hình 3.16. Kết quả trên Hình 3.16 A cho
thấy ở giếng 3 (LBp), giếng 4 (LB) cĩ xuất hiện vạch protein cĩ kích thước khoảng 9 kDa được xác nhận là 6xHis-MPI với mức độ biểu hiện tương ứng 18,5% và 17,5%. Ở giếng 1 (chứng âm) khơng thấy sự xuất hiện của vạch protein này. Kết quả biểu hiện này được xác nhận bằng phương pháp Western Blot lai với kháng thể kháng Histidine cho thấy protein biểu hiện trên giếng 3 và giếng 4 chính là 6xHis-MPI (Hình 3.16, B).
Hình 3.16. So sánh mức độ biểu hiện 6xHis-MPI khi nuơi cấy E. coli BL21 (DE3)/pET43Ins trên mơi trường LBp với mơi trường LB.
A, SDS-PAGE; B, Western Blot. Giếng 1, Thang protein; 2, Chứng âm; 3, Mơi trường LBp; 4, Mơi trường LB.
6xHis-MPI 14,4kDa
Luận án Tiến sĩ Kết quả –Biện luận
Các kết quả thu nhận được trên đây cho phép khẳng định rằng cĩ thể thay thế trypton trong mơi trường LB bằng pepton mà khơng gây bất kỳ ảnh hưởng xấu nào đối với sự tăng trưởng cũng như mức độ biểu hiện protein mục tiêu
6xHis-MPI chủng E. coli BL21(DE3)/pET43Ins. Từ đây, chúng tơi sử dụng
pepton để thay thế cho trypton trong pha chế mơi trường nuơi cấy cho các thí nghiệm nghiên cứu về sau.
b. Khảo sát điều kiện nuơi cấy mật độ cao
Do protein mục tiêu 6xHis-MPI được tổng hợp trong tế bào chủng E. coli
BL21(DE3)/pET43Ins dưới dạng khơng tan trong tế bào chất nên để thu nhận được nhiều 6xHis-MPI cần phải lên men và cảm ứng thu nhận lượng lớn sinh
khối E. coli BL21(DE3)/pET43Ins. Để thu nhận lượng sinh khối lớn của tế bào
chủng E. coli BL21(DE3)/pET43Ins cĩ khả năng biểu hiện 6xHis-MPI, chúng tơi
tiến hành thí nghiệm nuơi cấy mẻ-bổ sung mật độ tế bào cao với các mơi trường
khảo sát là H-LBp và aH-LBp được thiết kế trên cơ sở của mơi trường LBp cĩ
thành phần đơn giản, rẻ tiền nhưng vẫn bảo đảm được các yếu tố khống vi lượng cần thiết để vi sinh vật cĩ thể tăng trưởng và biểu hiện tốt (Bảng 2.2). Các bước tiến hành và các điều kiện kiểm sốt nuơi cấy như đã được mơ tả trong
phần Phương pháp 2.4.9 và sử dụng kết quả của các thí nghiệm trước. Kết quả
theo dõi quá trình tăng trưởng của chủng thơng qua giá trị OD600nm được trình
bày trên Hình 3.17. Khi nuơi cấy chủng theo phương thức mẻ-bổ sung mật độ tế
bào cao trên mơi trường H-LBp và aH-LBp, từ 0 - 6 giờ nuơi cấy chủng tăng trưởng giống nhau nhưng sau 6 giờ khả năng tăng trưởng của chủng trên mơi trường H-LBp yếu hơn so với trên mơi trường aH-LBp. Điều này cĩ thể giải thích là mơi trường H-LBp bị thiếu hụt một số khống vi lượng cần thiết cho tăng trưởng khi nuơi cấy mật độ tế bào cao. Khi bổ sung các khống này vào
Luận án Tiến sĩ Kết quả –Biện luận 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 0 4 8 12 16 20 24 28
Thời gian nuơi cấy
OD 6 0 0nm (*30 ) H-LBp aH-LBp
mơi trường nuơi cấy như trong trường hợp của aH-LBp thì sự tăng trưởng của chủng được duy trì ở mức cao cho đến khi kết thúc quá trình lên men.
Kết quả phân tích DCW khi kết thúc lên men cũng cho thấy ở trường hợp nuơi cấy trên mơi trường aH-LBp là 28,76 g/L, cao hơn so với trên mơi trường H-LBp, 25,48 g/L. Hiệu suất thu nhận sinh khối trên mơi trường aH-LBp cao hơn trên mơi trường H-LBp khoảng 13% do mơi trường aH-LBp cĩ chứa nhiều thành phần khống, phù hợp cho việc tổng hợp sinh khối cao. Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu trước đây của Shin et al (1997) [59] khi nuơi cấy E. coli mật độ tế bào cao phải bổ sung các khống vi lượng vào trong thành phần mơi trường, tuy nhiên hiệu suất thu nhận sinh khối thì thấp hơn. Nguyên nhân cĩ thể là do sự khác biệt về thành phần mơi trường và một số điều kiện lên men. Mơi
Hình 3.17. Động học tăng trưởng của chủng E. coli BL21(DE3)/pET43Ins khi nuơi cấy mẻ- bổ sung mật độ tế bào cao trên hai mơi trường H-LBp và aH-LBp.
Luận án Tiến sĩ Kết quả –Biện luận
trường nuơi cấy sử dụng trong nghiên cứu là aH-LBp cĩ thành phần khác với mơi trường trong báo cáo của Shin (sử dụng glucose nồng độ làm cơ chất và bổ sung dung dịch ion kim loại hỗn hợp (trace elements solution)).
Kết quả biểu hiện protein tái tổ hợp 6xHis-MPI khi nuơi cấy mẻ-bổ sung mật độ tế bào cao trong cả hai trường hợp mơi trường H-LBp và aH-LBp được trình bày trên Hình 3.18.
Hình 3.18. So sánh mức độ biểu hiện 6xHis-MPI khi nuơi cấy E. coli BL21 (DE3)/pET43Ins theo phương thức mẻ- bổ sung mật độ tế bào cao trên mơi trường H-LBp với mơi trường aH-LBp.
A, SDS-PAGE ; B, Western Blot. Giếng 1, Thang protein; 2, Chứng âm; 3, Mơi trường H-LBp; 4, Mơi trường aH-LBp.
Ở giếng 3 và 4 (Hình 3.18 A) cĩ xuất hiện các vạch protein cĩ kích thước
khoảng 9 kDa, với mức độ biểu hiện như nhau, tương ứng là 17,2% và 17,4%, được xác định là 6xHis-MPI. Ở giếng 2 (chứng âm) khơng thấy sự xuất hiện của vạch protein này. Kết quả biểu hiện này được xác nhận bằng phương pháp Western Blot lai với kháng thể kháng Histidine (Hình 3.18 B).
14,4 20,1
6xHis-MPI
B A
Luận án Tiến sĩ Kết quả –Biện luận
Từ các kết quả thu nhận được trên đây, chúng tơi cĩ thể khẳng định là đã thành cơng trong việc thiết lập được mơi trường aH-LBp, cĩ thành phần phù hợp và đã xây dựng được chế độ bổ sung mơi trường dinh dưỡng thích hợp để nuơi cấy E. coli BL21(DE3)/pET43Ins theo phương thức nuơi cấy mẻ- bổ sung mật độ tế bào cao để biểu hiện vượt mức protein tái tổ hợp 6xHis-MPI ở qui mơ phịng thí nghiệm với thể tích bình lên men 5 L.
3.2.4. Nuơi cấy E. coli BL21(DE3)/pET43Ins theo phương thức mẻ- bổ sung ở qui mơ 30 L để tổng hợp 6xHis-MPI